孫圣福，陳 偉，徐 鴻，徐 聰，藺曉月，邢林林，李玉杰，蘭鄒然，田夫林

（1.山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東濟(jì)南 250100；2.濟(jì)南市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東濟(jì)南 250100）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種豬的高度接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)為高熱、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血。其病死率高達(dá)100%，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。2018年8 月，王清華等[1]首次報(bào)道了我國(guó)首例非洲豬瘟的確診。2019 年4 月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定生豬屠宰企業(yè)要按照“批批檢、全覆蓋”的原則開展非洲豬瘟檢測(cè)[2]。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力比對(duì)是評(píng)價(jià)和提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力和管理水平的重要手段[3-4]。按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求，2020 年3 月，山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心組織全省319 家生豬屠宰企業(yè)開展非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)能力比對(duì)工作。本次檢測(cè)能力比對(duì)，客觀反映了生豬屠宰企業(yè)非洲豬瘟病毒檢測(cè)能力，也發(fā)現(xiàn)了其中存在的問題，對(duì)山東省以及其他省份非洲豬瘟防控起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 比對(duì)項(xiàng)目、方法

比對(duì)項(xiàng)目為非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)，檢測(cè)方法采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Q-PCR），具體操作按照相應(yīng)檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2 參與企業(yè)

山東省319 家生豬屠宰企業(yè)全部參與本次非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)能力比對(duì)。

1.3 樣品和試劑

樣品為包含非洲豬瘟病毒基因組的液體樣品，由青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心提供并標(biāo)定，由山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心致盲后重新分組編號(hào)。1 595 份樣品分為319 組，每組5 份樣品，包含強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性3 個(gè)滴度各1 份，其余2 份樣品從樣品庫(kù)中隨機(jī)抽取。樣品由參加檢測(cè)能力比對(duì)的屠宰企業(yè)自行領(lǐng)取，并于12 h內(nèi)送至各自實(shí)驗(yàn)室，收到樣品48 h 內(nèi)反饋結(jié)果。

檢測(cè)試劑由各參加比對(duì)的屠宰企業(yè)自行在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)的或經(jīng)中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心評(píng)價(jià)后公布的診斷試劑目錄中購(gòu)買。

1.4 結(jié)果判定

屠宰企業(yè)盲樣檢測(cè)結(jié)果與參考值一致，判定為樣品檢測(cè)結(jié)果正確；5 份樣品結(jié)果完全一致，判定為該企業(yè)檢測(cè)結(jié)果合格；1 份或1 份以上樣品檢測(cè)結(jié)果與參考值不一致，判定為該企業(yè)檢測(cè)結(jié)果不合格。

假陽(yáng)性即為將參考值為陰性的樣品檢測(cè)為陽(yáng)性；假陰性即為將參考值為陽(yáng)性的樣品檢測(cè)為陰性。

2 比對(duì)結(jié)果

2.1 總體情況

319 個(gè)屠宰企業(yè)中，按時(shí)提交檢測(cè)結(jié)果的有314 個(gè)，結(jié)果反饋率為98.43%。反饋結(jié)果的企業(yè)中，有225 個(gè)企業(yè)檢測(cè)結(jié)果合格，合格率為71.66%（225/314）。1 570 份樣品中，有1 389 份樣品檢測(cè)結(jié)果正確，樣品正確率為88.47%。其中有1 份樣品檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤的屠宰企業(yè)有43 個(gè)，2～4 份樣品檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤的有44 個(gè)，2 個(gè)屠宰企業(yè)檢測(cè)結(jié)果完全錯(cuò)誤。詳見表1。

表1 生豬屠宰企業(yè)非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)能力比對(duì)總體結(jié)果

2.2 不同規(guī)模類型屠宰企業(yè)

314 個(gè)生豬屠宰企業(yè)中，A 類企業(yè)（屠宰產(chǎn)品可在全國(guó)范圍內(nèi)流通）187 家、B 類企業(yè)（屠宰產(chǎn)品僅限省內(nèi)流通）127 家，A 類和B 類屠宰企業(yè)合格率分別為79.14%和60.63%。

表2 不同類型生豬屠宰企業(yè)非洲豬瘟檢測(cè)能力比對(duì)結(jié)果

2.3 檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤的屠宰企業(yè)情況

出現(xiàn)結(jié)果錯(cuò)誤的89 個(gè)屠宰企業(yè)中，有9 個(gè)（10.11%）出現(xiàn)假陽(yáng)性，74 個(gè)（83.15%）出現(xiàn)假陰性，6 個(gè)（6.74%）既有假陽(yáng)性又有假陰性（表3）。

表3 錯(cuò)誤屠宰企業(yè)情況

3 分析與討論

3.1 比對(duì)總體情況

參加非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)能力比對(duì)的屠宰企業(yè)有319 家，除了5 家沒有按照規(guī)定反饋結(jié)果外，其余314 家均及時(shí)反饋了檢測(cè)結(jié)果。其中225 家為合格，占71.66%，尚有89 家屠宰企業(yè)檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤。針對(duì)這種情況，山東省畜牧獸醫(yī)局及各市縣畜牧獸醫(yī)主管部門已經(jīng)責(zé)令89 家檢測(cè)結(jié)果不合格的和5 家未反饋結(jié)果的屠宰企業(yè)進(jìn)行停產(chǎn)整頓，并展開現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查和督導(dǎo)，限定時(shí)間內(nèi)達(dá)不到檢測(cè)要求的取締其生豬屠宰資格。

3.2 不同類型屠宰企業(yè)情況

從結(jié)果看，A 類企業(yè)檢測(cè)結(jié)果好于B 類企業(yè)，這也與遼寧省的情況一致[4]。究其原因：A 類屠宰企業(yè)屠宰量大，屠宰流程更規(guī)范，對(duì)非洲豬瘟檢測(cè)重視程度較B 類企業(yè)高；其產(chǎn)品在全國(guó)流通，一旦出現(xiàn)問題將會(huì)影響其在全國(guó)的銷售，因此更加重視產(chǎn)品質(zhì)量。B 類企業(yè)屠宰量小，產(chǎn)品僅在省內(nèi)流通，部分小型屠宰企業(yè)產(chǎn)品僅在市縣范圍內(nèi)流通，囿于成本考慮，對(duì)非洲豬瘟檢測(cè)設(shè)施設(shè)備和人員的投入僅能滿足最低要求；而且由于生豬出欄數(shù)量降低和生豬價(jià)格上漲，一些B 類屠宰企業(yè)難以生存，也很難增加非洲豬瘟檢測(cè)投入。

3.3 出現(xiàn)假陰性原因

檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤的企業(yè)中，存在假陰性結(jié)果的企業(yè)有74 個(gè)，占出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果屠宰企業(yè)的83.15%。假陰性即為將真實(shí)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品檢測(cè)為陰性。經(jīng)調(diào)查分析有以下幾種原因：一是屠宰企業(yè)自身不重視非洲豬瘟檢測(cè)，沒有投入足夠的資金、人員，實(shí)驗(yàn)室設(shè)施設(shè)備不完善；二是從事檢測(cè)的人員不具備檢測(cè)能力，沒有完全掌握儀器設(shè)備的基本操作，試驗(yàn)操作不規(guī)范，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果也缺乏應(yīng)有的專業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，不會(huì)判定陰、陽(yáng)性結(jié)果；三是實(shí)驗(yàn)室設(shè)施設(shè)備不達(dá)標(biāo)，缺乏檢測(cè)必備的儀器設(shè)備，多采用免核酸提取的方法進(jìn)行檢測(cè)，采用的熒光定量PCR 儀多為國(guó)產(chǎn)儀器，靈敏度不夠；四是試劑運(yùn)輸和保存不規(guī)范，熒光定量PCR 試劑應(yīng)在低溫環(huán)境下運(yùn)輸，在-15 ℃以下冷凍保存，而某些屠宰企業(yè)未按照試劑所需溫度、條件運(yùn)輸和保存，造成試劑敏感性下降；五是實(shí)驗(yàn)室布局不合理，沒有獨(dú)立封閉區(qū)域，部分屠宰企業(yè)從生活區(qū)隨意選取房間開展檢測(cè)，與檢測(cè)無關(guān)的人員自由出入，導(dǎo)致檢測(cè)環(huán)境不夠潔凈；六是檢測(cè)采用的耗材質(zhì)量不過關(guān)，試驗(yàn)所用的eppendorf 管、Tip 槍頭等潔凈度不夠，造成核酸降解，選用的PCR 管透明度不夠，無法吸收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)。

3.4 出現(xiàn)假陽(yáng)性原因

檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤的企業(yè)中，存在假陽(yáng)性結(jié)果的企業(yè)有9 個(gè)，占出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果屠宰企業(yè)的10.11%。假陽(yáng)性即為將真實(shí)結(jié)果為陰性的樣品檢測(cè)為陽(yáng)性。經(jīng)調(diào)查分析有以下幾種原因：一是實(shí)驗(yàn)室布局不合理，配液區(qū)、樣品處理區(qū)、核酸提取區(qū)和擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)之間沒有物理隔斷，沒有單向順序，儀器耗材沒有單向流動(dòng)，擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的核酸累積造成污染；二是實(shí)驗(yàn)室硬件不達(dá)標(biāo)，缺少樣品處理、核酸提取等需要的生物安全柜，所有操作都在開放環(huán)境中進(jìn)行，造成了環(huán)境污染；三是操作不規(guī)范，操作過程中陽(yáng)性對(duì)照沒有離心直接開蓋，產(chǎn)生氣溶膠造成污染，加樣過程中移液器使用不當(dāng)造成污染等；四是不消毒或者消毒不徹底，試驗(yàn)結(jié)束后，未對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、儀器設(shè)備進(jìn)行清潔消毒，或者消毒不規(guī)范，從下游區(qū)域向上游區(qū)域消毒，且采用同樣的抹布擦拭，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)生的核酸通過抹布帶到上游區(qū)域，對(duì)下一次檢測(cè)造成污染。

4 建議和對(duì)策

4.1 加強(qiáng)對(duì)非洲豬瘟檢測(cè)的重視

生豬屠宰環(huán)節(jié)開展非洲豬瘟檢測(cè)對(duì)于非洲豬瘟防控有重要意義。一旦攜帶非洲豬瘟病毒的生豬進(jìn)入屠宰環(huán)節(jié)而沒有被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，就會(huì)造成整個(gè)屠宰場(chǎng)污染。屠宰企業(yè)與養(yǎng)殖場(chǎng)之間存在人員、車輛、工具等的頻繁接觸，存在病毒匯集、擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，屠宰企業(yè)應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)非洲豬瘟檢測(cè)的投入，如投入足夠資金建設(shè)科學(xué)規(guī)范的實(shí)驗(yàn)室，聘請(qǐng)具備相應(yīng)檢測(cè)能力的專業(yè)技術(shù)人員，購(gòu)置精密的儀器設(shè)備，選用合格的檢測(cè)試劑和耗材等。

4.2 加強(qiáng)對(duì)技術(shù)人員的培訓(xùn)

非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)是一項(xiàng)專業(yè)性較強(qiáng)的技術(shù)工作，需要專業(yè)的技術(shù)人員開展，人員的技術(shù)水平和規(guī)范操作與檢測(cè)結(jié)果的正確性成正比。從調(diào)查結(jié)果來看，屠宰企業(yè)檢測(cè)人員整體專業(yè)化程度不高，大多未從事過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等專業(yè)技術(shù)操作，未培訓(xùn)上崗的人員占據(jù)一定比例。針對(duì)這種現(xiàn)象，山東省畜牧獸醫(yī)局要求各級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)對(duì)屠宰企業(yè)檢測(cè)技術(shù)人員開展專業(yè)操作技術(shù)培訓(xùn)，培訓(xùn)合格后方可上崗。

4.3 加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施的建設(shè)

實(shí)驗(yàn)室布局不合格，硬件設(shè)備不達(dá)標(biāo)，是導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤的重要影響因素之一。針對(duì)這種現(xiàn)象，山東省畜牧獸醫(yī)局起草了屠宰企業(yè)非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室管理制度，內(nèi)容包含實(shí)驗(yàn)室位置、布局、儀器設(shè)備、人員要求、實(shí)驗(yàn)室管理、檢測(cè)工作要求等要素，指導(dǎo)屠宰企業(yè)開展非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)工作。

4.4 加強(qiáng)對(duì)屠宰企業(yè)的監(jiān)管

畜牧獸醫(yī)主管部門應(yīng)加強(qiáng)屠宰企業(yè)監(jiān)管，定期對(duì)其產(chǎn)品或留存的樣品進(jìn)行抽檢，以便能及時(shí)發(fā)現(xiàn)存在的問題，促進(jìn)屠宰企業(yè)進(jìn)行整改，同時(shí)引起屠宰企業(yè)的重視，避免其產(chǎn)生僥幸心理。