王晶晶，陳書強(qiáng)，董 杰，邸 曼，王曉紅

體外受精和胚胎移植輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology, ART)是通過(guò)對(duì)配子及早期胚胎進(jìn)行體外操作，以達(dá)到輔助不孕不育夫婦獲得妊娠的一系列技術(shù)[1]。然而，其安全性也引起生殖醫(yī)學(xué)專家的極大關(guān)注。研究顯示，與自然妊娠相比，ART子代出現(xiàn)早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量?jī)?、出生缺陷等不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[2]。胎盤作為孕期特有器官，不僅是母胎營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)的紐帶，還在維持正常妊娠過(guò)程中發(fā)揮重要的生理作用[3]。多項(xiàng)研究表明，ART子代胎盤出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能異常，與胎兒生長(zhǎng)受限等密切相關(guān)[4-6]。熱休克蛋白70(HSP70)是熱休克蛋白家族中最保守的一種細(xì)胞內(nèi)分子伴侶，可以參與蛋白質(zhì)的折疊、促進(jìn)蛋白質(zhì)泛素化和蛋白酶降解，在保護(hù)細(xì)胞免受各種外界應(yīng)激方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7-9]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是1986年首次發(fā)現(xiàn)的一種關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，幾乎存在于所有類型細(xì)胞的胞質(zhì)中，對(duì)免疫細(xì)胞活化、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等具有調(diào)節(jié)作用[10-11]。本研究擬采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及免疫印跡法檢測(cè)ART和自然妊娠子代胎盤中HSP70與NF-κB的表達(dá)情況，并探討二者變化與ART不良妊娠結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加的相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月—2019年6月在我院產(chǎn)科分娩的ART子代(ART組)和同期自然妊娠分娩的子代(對(duì)照組)作為研究對(duì)象。ART組納入標(biāo)準(zhǔn)：產(chǎn)婦年齡<35周歲，單胎妊娠,新生兒既往產(chǎn)檢正常且無(wú)出生缺陷,父母雙方染色體正常；排除標(biāo)準(zhǔn)：產(chǎn)婦孕前合并嚴(yán)重的內(nèi)外科并發(fā)癥(如嚴(yán)重的高血壓病、糖尿病、甲狀腺疾病等),行胚胎冷凍移植者,行體外受精或接受胚胎植入前遺傳學(xué)診斷者。對(duì)照組為自然妊娠分娩的子代，納入標(biāo)準(zhǔn)與ART組相同，排除孕前合并嚴(yán)重內(nèi)外科并發(fā)癥者。2組進(jìn)行年齡、孕周、產(chǎn)前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)配對(duì)，以消除偏移，最終共納入ART組46例(體外受精-胚胎移植41例、卵胞漿內(nèi)單精子注射5例)，對(duì)照組65例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本采集：胎盤娩出后，2組各選取20例胎盤，立刻稱重，并剪取臍帶附著部位的胎盤小葉組織2 cm×2 cm×2 cm，去除母體蛻膜后將胎盤絨毛置于4℃預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液中，漂洗多次至無(wú)血跡，分裝到冷凍管后立刻置于液氮中凍存1 h，最后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2.2實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平：將剪碎的胎盤組織加液氮研磨成粉末狀，用Trizol法抽提總RNA，用分光光度法進(jìn)行定量，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，采用SYBR Green試劑盒行實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)，用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成，見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)胎盤組織mRNA表達(dá)引物設(shè)計(jì)

1.2.3免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：用RIPA裂解液提取2份胎盤組織蛋白后，BCA法測(cè)定蛋白濃度，用SDS Loading Buffer變性，處理好的樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，牛血白蛋白溶液于4℃封閉過(guò)夜，洗滌后于37℃加入一抗孵育1 h，洗滌，37℃加入二抗孵育30 min，洗滌后顯影。一抗和二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3觀察指標(biāo) ①孕產(chǎn)婦基本情況：孕婦年齡、孕周、產(chǎn)前BMI及剖宮產(chǎn)比例；②孕產(chǎn)婦妊娠并發(fā)癥：妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、前置胎盤(中央性/部分性/邊緣性前置胎盤)、羊水異常(羊水過(guò)多/過(guò)少)、胎膜早破；③新生兒基本情況：新生兒出生體質(zhì)量，胎盤重量，胎盤效率[新生兒出生體質(zhì)量(g)/胎盤重量(g)]，早產(chǎn)(胎齡28～37周分娩的新生兒)，低出生體質(zhì)量(新生兒出生體質(zhì)量<2500 g)。④檢測(cè)2組胎盤HSP70、NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)情況,并分析其相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.12組產(chǎn)婦基本情況比較 ART組產(chǎn)婦年齡(26.54±4.85)歲，孕周(38.78±2.44)周，產(chǎn)前BMI(26.17±3.74)kg/m2，剖宮產(chǎn)比例為54.35%(25/46)；對(duì)照組產(chǎn)婦年齡(26.12±4.27)歲，孕周(38.88±2.17)周，產(chǎn)前BMI(25.89±3.65)kg/m2，剖宮產(chǎn)比例為43.08%(28/65)。2組產(chǎn)婦年齡、孕周、產(chǎn)前BMI和剖宮產(chǎn)比例等基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.22組產(chǎn)婦妊娠并發(fā)癥比較 與對(duì)照組相比，ART組產(chǎn)婦妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、羊水異常發(fā)生率均顯著升高(P<0.01)，前置胎盤和胎膜早破發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組產(chǎn)婦妊娠并發(fā)癥比較[例(%)]

2.32組新生兒基本情況比較 與對(duì)照組新生兒相比，ART組新生兒胎盤重量和早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量比率顯著升高(P<0.05)，新生兒重量和胎盤效率有降低趨勢(shì)但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 2組新生兒基本情況比較

2.42組胎盤組織中HSP70、NF-κB mRNA表達(dá)比較 ART組胎盤組織中HSP70、NF-κB mRNA表達(dá)量分別為(2.05±0.92)和(3.11±1.16)，對(duì)照組表達(dá)量分別為(0.76±0.35)和(1.18±0.65)，ART組胎盤組織中HSP70、NF-κB mRNA表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 2組胎盤組織中HSP70、NF-κB mRNA表達(dá)比較 ART組為采用輔助生殖技術(shù)妊娠，對(duì)照組為自然妊娠；HSP70為熱休克蛋白70，NF-κB為核轉(zhuǎn)錄因子-κB，ART為輔助生殖技術(shù)；與對(duì)照組比較，aP<0.05

2.52組胎盤組織中HSP70、NF-κB蛋白表達(dá)比較 ART組胎盤組織中HSP70、NF-κB蛋白表達(dá)量分別為(2.63±1.05)和(5.36±1.56)，對(duì)照組表達(dá)量分別為(1.72±0.86)和(2.45±0.89)，ART組胎盤組織中HSP70、NF-κB蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 2組胎盤組織中HSP70、NF-κB蛋白表達(dá)比較 A為胎盤組織HSP70、NF-κB蛋白印跡條帶，B為胎盤組織HSP70、NF-κB蛋白印跡灰度分析結(jié)果；ART組為采用輔助生殖技術(shù)妊娠，對(duì)照組為自然妊娠；HSP70為熱休克蛋白70，NF-κB為核轉(zhuǎn)錄因子-κB，β-actin為內(nèi)參基因；與對(duì)照組比較，aP<0.05

2.6胎盤組織中HSP70、NF-κB表達(dá)相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示：胎盤組織中HSP70與NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.865,P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 胎盤組織中HSP70、NF-κB表達(dá)相關(guān)性分析 HSP70為熱休克蛋白70，NF-κB為核轉(zhuǎn)錄因子-κB

3 討論

ART是指在體外對(duì)配子及早期胚胎進(jìn)行的使不孕不育夫婦獲得妊娠的一系列操作，但其引發(fā)的醫(yī)源性應(yīng)激可能致妊娠期并發(fā)癥及子代健康風(fēng)險(xiǎn)增加[2,12]，具體機(jī)制尚未闡明。胎盤由囊胚的滋養(yǎng)外胚層發(fā)育而來(lái)，是孕期特有器官，其不僅是母胎間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移的紐帶，同時(shí)還具有促進(jìn)新陳代謝、保護(hù)內(nèi)分泌等功能[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，ART助孕的孕產(chǎn)婦妊娠期并發(fā)癥發(fā)病率顯著升高，同時(shí)ART子代早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，這可能與胎盤的結(jié)構(gòu)和功能異常相關(guān)。

臨床研究顯示，特定的應(yīng)激環(huán)境(病理或生理刺激)下，細(xì)胞內(nèi)HSP70將通過(guò)細(xì)胞壞死和替代途徑分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞外HSP70可以發(fā)揮趨化因子功能,誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6等炎癥細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)和NF-κB發(fā)生核移位，進(jìn)而促進(jìn)更多炎癥細(xì)胞因子的釋放[14]。研究證實(shí)，過(guò)度的外源性或內(nèi)源性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致HSP70水平升高，通過(guò)NF-κB信號(hào)通路影響精子形成、卵巢早衰和先兆子癇、妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓、早產(chǎn)等妊娠并發(fā)癥發(fā)生[15-17]。

有研究發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中細(xì)胞凋亡率、HSP70表達(dá)水平均顯著高于自然流產(chǎn)患者，推測(cè)過(guò)度表達(dá)的HSP70可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而引起自然流產(chǎn)[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期糖尿病孕婦的血清及胎盤組織中HSP70和NF-κB p65呈高表達(dá)狀態(tài)，引起胎盤結(jié)構(gòu)和功能的變化并協(xié)同促進(jìn)妊娠期糖尿病的發(fā)生[16-17]。還有研究發(fā)現(xiàn)，胎盤組織中HSP70 和NF-κB過(guò)度表達(dá)，可能與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，ART子代胎盤組織中HSP70與NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，且呈正相關(guān)。表明在宮內(nèi)炎癥和氧化應(yīng)激狀態(tài)下，二者協(xié)同作用維持正常妊娠，但是其過(guò)度的高表達(dá)可能與ART不良妊娠結(jié)局相關(guān)。

綜上，ART可導(dǎo)致子代胎盤組織過(guò)度生長(zhǎng)，且胎盤組織中HSP70和NF-κB表達(dá)水平顯著升高，這可能與ART助孕的孕產(chǎn)婦更易發(fā)生妊娠期并發(fā)癥且ART助孕新生兒不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，但是具體機(jī)制尚不清楚。同時(shí)，本研究仍存在一些不足之處，如納入樣本量較少且未行亞組分析，后期仍需開展大樣本綜合性研究。