孟 鑫，李 穎，胡靖之，譚 晶，白 羽，趙 晴，陳景偉

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis， EMs)是指具有活性的子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))生長在宮腔被覆黏膜以外的部位[1]，是婦女慢性盆腔疼痛、不孕、痛經(jīng)的主要原因之一，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。由于目前EMs的發(fā)病機(jī)制依然不甚明確，臨床治療效果也欠佳，動物模型就成為深入研究EMs必不可少的工具。理想的EMs動物模型應(yīng)具備良好的臨床相似性，相似性越高越有利于EMs發(fā)病機(jī)制及臨床治療等方面的研究，現(xiàn)階段EMs動物模型建立方法發(fā)展已較成熟[2]，但關(guān)于模型建立成功最佳周期的相關(guān)研究還較少，研究結(jié)果也不盡相同，短至4 d[3]，長達(dá)4周[4]，因此有必要對EMs最佳造模時間進(jìn)行考察，本研究采用自體移植法構(gòu)建KM小鼠EMs模型，對最佳造模周期進(jìn)行探索，并動態(tài)觀察不同時間異位病灶的生長情況及組織形態(tài)學(xué)特點，以期為EMs的后續(xù)研究提供最佳的實驗觀察時機(jī)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇SPF級雌性KM小鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g；購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0011，實驗動物使用許可證號：SYXK(冀)2016-0047。實驗動物飼養(yǎng)及觀察在河北中醫(yī)學(xué)院科研中心進(jìn)行，期間給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水，通風(fēng)良好。

1.2藥品和試劑 戊酸雌二醇片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號：469A；硫酸慶大霉素注射液，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號：068180408；0.9%氯化鈉注射液，異氟烷，4%多聚甲醛溶液，2%戊巴比妥鈉溶液，碘伏，蘇木素染液，伊紅染液。

1.3主要儀器及設(shè)備 VMR型小動物麻醉機(jī)，美國MIDMARK公司生產(chǎn)。

1.4實驗分組及造模方法 根據(jù)實驗設(shè)計，將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組10只和模型組40只。造模方法參考文獻(xiàn)[5]并加以改進(jìn)，造模前3 d將戊酸雌二醇片1 mg研碎于蒸餾水20 ml中配成1︰20的混懸液，以1 mg/kg劑量連續(xù)灌胃3 d，并做陰道涂片，使其處于統(tǒng)一的動情周期。造模時手術(shù)全程在小動物麻醉機(jī)下進(jìn)行，采用異氟烷持續(xù)吸入方式麻醉小鼠，將異氟烷倒入麻醉機(jī)中，將小鼠放入麻醉機(jī)誘導(dǎo)盒內(nèi)，1 min后小鼠麻醉成功，取出仰臥位固定，并為其戴上面罩，以維持麻醉效果。碘伏常規(guī)消毒腹部皮膚，鋪巾，于尿道口上方2 cm處沿腹部正中線縱行切開，切口約3 cm，逐層剖開，找到左側(cè)子宮，于近卵巢端結(jié)扎子宮兩端，剪下中間段約2 cm并迅速放入0.9%氯化鈉注射液中，修剪其余組織后將其縱行剪開，并注意區(qū)分子宮內(nèi)外面，展開，將其內(nèi)膜面貼附于小鼠右側(cè)距切口2 cm處的腹壁內(nèi)面上，并用4-0可吸收線將子宮塊對角縫合固定于腹腔內(nèi)壁，硫酸慶大霉素注射液沖洗腹腔后逐層關(guān)腹。手術(shù)操作保持無菌，全程操作在5 min內(nèi)完成。在造模后第1、2、3、4周分別觀察異位病灶生長情況及形態(tài)學(xué)特征。假手術(shù)組開腹找到左側(cè)子宮后常規(guī)關(guān)腹，于術(shù)后第4周處理。

1.5組織收集及處理 模型組分別于術(shù)后第1、2、3、4周采用2%戊巴比妥鈉溶液45 mg/kg行腹腔注射麻醉，麻醉成功后碘伏消毒腹部并沿腹部正中線剖開，觀察異位病灶生長情況，取腹壁異位病灶及一側(cè)子宮，去除多余脂肪組織和血跡，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片行HE染色，顯微鏡下觀察病理特征。

1.6造模成功評定標(biāo)準(zhǔn)[6]移植物體積增大；移植物表面及附近有新生血管形成；移植物生長為透明或半透明樣的囊泡狀，呈暗紅色或棕色，內(nèi)含清亮液體；病理檢查可見子宮內(nèi)膜腺體組織和間質(zhì)細(xì)胞，其間有炎性細(xì)胞浸潤。

1.7觀察指標(biāo)

1.7.1大體觀察：取材同時觀察異位病灶存活率，生長情況，位置及與周圍組織的關(guān)系；用雙腳規(guī)測量異位病灶的大小，并計算異位病灶體積，留取異位病灶進(jìn)行稱重。

1.7.2組織形態(tài)學(xué)觀察：將已固定好的組織常規(guī)石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟并HE染色處理后，于顯微鏡下觀察異位病灶及子宮內(nèi)膜的組織形態(tài)學(xué)特點和差異。

2 結(jié)果

2.1術(shù)后存活率 本實驗采用自體移植法建立EMs小鼠模型，術(shù)后第1天1只小鼠死亡，可能與術(shù)后損傷大血管出血過多有關(guān)，其余小鼠全部存活，術(shù)后存活率高達(dá)97.5%。

2.2造模成功率 根據(jù)造模成功評定標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)大體觀察和組織病理學(xué)分析判定計算造模成功率，造模成功率(%)=移植成功小鼠只數(shù)/造模小鼠總只數(shù)×100%。結(jié)果顯示，術(shù)后1、2、3、4周造模成功率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同時間小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型建立成功率比較

2.3大體觀察

2.3.1異位病灶形態(tài)：與EMs患者病灶表現(xiàn)相似[7]，模型組小鼠異位病灶形態(tài)也呈現(xiàn)多樣性，其顏色、粘連情況隨著時間的延長而逐漸變化。造模術(shù)后1周可觀察到移植組織塊已與腹壁組織牢固黏附，并生長為異位結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬，呈隆起的小囊泡狀，內(nèi)含液體，表面覆蓋有小的新生血管和脂肪組織，異位病灶顏色較暗，半透亮，部分與周圍脂肪組織廣泛粘連，可分離，見圖1A。術(shù)后2周可見異位病灶顏色為暗紅色或棕色，呈透亮囊泡狀，內(nèi)含渾濁液體，表面有豐富的新生血管覆蓋，與周圍組織粘連較致密，見圖1B。術(shù)后3周與術(shù)后4周均可見異位病灶呈透亮的小囊泡狀，內(nèi)部充滿清亮液體，質(zhì)地柔軟，表面覆蓋更為豐富的血管網(wǎng)，見圖1C、1D。隨著造模周期的延長，盆腔粘連更加廣泛嚴(yán)重，異位病灶常包埋在粘連組織里，見圖1E。假手術(shù)組小鼠均未見異位病灶形成。

圖1 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠造模術(shù)后不同時間異位病灶生長特點 A：模型組小鼠術(shù)后1周；B：模型組小鼠術(shù)后2周；C：模型組小鼠術(shù)后3周；D：模型組小鼠術(shù)后4周；E：模型組小鼠術(shù)后3周粘連情況

2.3.2異位病灶體積、重量及形態(tài)、顏色、粘連和血管生成情況：隨著造模周期的延長，模型組小鼠異位病灶體積和重量不斷變化，與術(shù)后1周、2周相比，術(shù)后3周、4周異位病灶體積明顯增大，術(shù)后3周、4周異位病灶重量明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；而術(shù)后1周與2周相比、術(shù)后3周與4周相比，無論是異位病灶體積還是重量，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠造模術(shù)后不同時間異位病灶體積、重量及形態(tài)、顏色、粘連和血管生成情況比較

2.4HE染色鏡下觀察 低倍鏡下：可見異位病灶已生長為1個或多個囊腔樣結(jié)構(gòu)，腔內(nèi)均質(zhì)呈淡染，未見細(xì)胞結(jié)構(gòu)，異位病灶各層結(jié)構(gòu)與在位子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)相似，腔內(nèi)壁由上皮細(xì)胞層、間質(zhì)細(xì)胞層、肌層組成，腔外壁覆蓋一層纖維結(jié)締組織，但與在位子宮內(nèi)膜不同的是，異位內(nèi)膜各層結(jié)構(gòu)薄厚不一，層次不明，間質(zhì)與肌層組織界限不清，常錯雜交織在一起，見圖2。高倍鏡下：異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞層以砥柱狀細(xì)胞或立方狀細(xì)胞呈環(huán)形或鋸齒狀生長，部分上皮細(xì)胞可見核下空泡和頂漿分泌，部分區(qū)域內(nèi)膜也可呈乳頭狀生長，有炎性細(xì)胞浸潤；間質(zhì)細(xì)胞層內(nèi)可見豐富的血管，但腺體數(shù)量相對在位子宮內(nèi)膜稀少，甚至消失，腺上皮細(xì)胞呈柱狀或立方狀；肌層較薄，平滑肌的環(huán)形、縱狀結(jié)構(gòu)不清晰，其內(nèi)血管相對較少，有不同程度的纖維化。見圖3。

圖2 子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠子宮及異位病灶HE染色低倍鏡下特征(×200) A：術(shù)后1周子宮；B：術(shù)后1周異位病灶；C：術(shù)后2周子宮；D：術(shù)后2周異位病灶；E：術(shù)后3周子宮；F：術(shù)后3周異位病灶；G：術(shù)后4周子宮；H：術(shù)后4周異位病灶

圖3 子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠子宮及異位病灶HE染色高倍鏡下特征(×400) A：術(shù)后1周子宮；B：術(shù)后1周異位病灶；C：術(shù)后2周子宮；D：術(shù)后2周異位病灶；E：術(shù)后3周子宮；F：術(shù)后3周異位病灶；G：術(shù)后4周子宮；H：術(shù)后4周異位病灶

3 討論

EMs是一種周期性、激素依賴性的婦科常見慢性疾病，具有復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、侵襲等惡性疾病特點，其發(fā)病率逐年上升[8-12]。EMs發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，常見的發(fā)病機(jī)制理論有經(jīng)血逆流學(xué)說、化生學(xué)說、轉(zhuǎn)移學(xué)說、新生兒宮血學(xué)說等[13]，但到目前為止，仍然沒有一種學(xué)說可以完全解釋EMs的發(fā)生原因，臨床治療效果也欠佳。因此，動物模型就成為研究EMs發(fā)病機(jī)制、發(fā)展動態(tài)變化及臨床治療策略的理想工具。

目前可以用于構(gòu)建EMs模型的動物主要包括靈長類動物、嚙齒類動物等[14]。靈長類動物雖然可以自發(fā)性形成EMs，但是受價格昂貴、造模周期長等原因的限制而無法廣泛使用。而嚙齒類動物價格便宜，動情周期短，造模成功率高，尤其是鼠類成了現(xiàn)階段EMs模型建立的常選動物類型。已有的鼠類EMs模型的構(gòu)建方法主要分為同種移植和異種移植，其中常用的同種移植方法有自體移植法和腹腔注射法。雖然腹腔注射法造模很大程度上避免了手術(shù)對動物的創(chuàng)傷，但是實驗過程中需要一批供體小鼠，增加了實驗成本，另外還會存在受體小鼠對非自然組織的排異反應(yīng)等問題，從而影響實驗效果。所以本研究采用KM小鼠以自體移植法來建立EMs模型，考慮到小鼠子宮較小，分離子宮內(nèi)膜的難度太大，為了保證實驗的順利進(jìn)行，我們將子宮全層組織通過手術(shù)的方式移植至小鼠腹壁上，成功建立了有效、理想的EMs模型，并于造模后選取了1周、2周、3周、4周不同的時間段分別從造模成功率、大體形態(tài)及HE染色方面進(jìn)行動態(tài)觀察，從而找出EMs小鼠模型的最佳造模周期。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，EMs動物模型的建立方法多樣，成功率也不盡相同，本實驗采用自體移植法建立EMs小鼠模型，術(shù)后小鼠存活率高達(dá)97.5%，與實驗人員操作熟練、手術(shù)時間短、手術(shù)過程保持無菌、關(guān)腹前抗生素沖洗腹腔降低感染、術(shù)中采用小動物麻醉機(jī)避免麻醉過量等因素有關(guān)。實驗在不同時間經(jīng)大體和組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)部分EMs小鼠模型在術(shù)后1周時即可有異位病灶形成，可用于EMs早期形成的相關(guān)研究；4個時間點間的造模成功率雖然并無差異，但是術(shù)后1周略低于術(shù)后2、3、4周，可能與異位病灶生長時間較短、生長不充分有關(guān)。此外，在實驗過程中還發(fā)現(xiàn)，異位病灶的顏色、形態(tài)及粘連情況隨著時間的延長而不斷改變，異位病灶從早期呈暗紅色、棕色，不斷發(fā)展為后期的白色或透亮，囊泡的形態(tài)也逐漸由半透亮發(fā)展為透亮，血管不斷生長，粘連逐漸加重，也從側(cè)面反映了實驗造模過程符合EMs的自然發(fā)展規(guī)律，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論一致[15]。本實驗還通過觀察不同時間小鼠異位病灶發(fā)現(xiàn)，無論是異位病灶體積還是重量，術(shù)后1周、2周皆明顯小于術(shù)后3周、4周，提示異位病灶在早期呈現(xiàn)出不斷生長的趨勢；術(shù)后3周與4周異位病灶體積和重量比較差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，且發(fā)現(xiàn)術(shù)后4周異位病灶較術(shù)后3周異位病灶生長周期長，囊腫表面張力增大，盆腔粘連范圍擴(kuò)大，粘連組織增厚，操作過程中剝離難度增加，極易造成異位病灶囊壁破損。另外，結(jié)合組織病理學(xué)觀察可見術(shù)后3周異位病灶已出現(xiàn)了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，腺體或腺體樣結(jié)構(gòu)和間質(zhì)改變，與術(shù)后4周無差別。實驗結(jié)果提示EMs造模術(shù)后3周是較理想的觀察時機(jī)，這時異位病灶的生長已趨于穩(wěn)定，體積、重量均已達(dá)到最佳，操作方便，剝離成功率高，組織形態(tài)學(xué)也發(fā)展成熟，無需再等到術(shù)后4周觀察，進(jìn)而縮短了實驗周期，減少了人力和物力的浪費(fèi)。

理想的動物模型應(yīng)該盡可能地接近人類疾病的生長進(jìn)程，可以準(zhǔn)確地反映疾病的特點和發(fā)展過程，而成功建立EMs動物模型，并選擇最佳的觀察時間，對于確保實驗的下一步進(jìn)行有著至關(guān)重要的作用。根據(jù)本實驗結(jié)果，以KM小鼠自體移植法可以成功建立EMs模型，并進(jìn)一步驗證了在造模術(shù)后1周便可成功觀察到部分異位病灶，其生長過程符合疾病的自然規(guī)律，持續(xù)生長至術(shù)后3周時達(dá)到最佳狀態(tài)，后漸趨于穩(wěn)定。本研究結(jié)果便于后續(xù)根據(jù)具體實驗?zāi)康倪x擇最佳的觀察時機(jī)，也為EMs各方面深入研究提供了一定程度的參考價值。