董雪琪，高 燕

骨骼肌是人的運動器官，負責運動和體熱的產(chǎn)生。近年研究證實，骨骼肌具有內分泌功能并能合成、分泌多種肌肉因子，通過自分泌、旁分泌、內分泌的方式參與機體葡萄糖和脂肪酸代謝[1-3]。多種肌肉因子被認為是預防2型糖尿病等慢性代謝性疾病的重要因素[4-5]。musclin作為骨骼肌細胞特異性分泌的多肽蛋白質，受營養(yǎng)條件和激素尤其是胰島素的調控參與細胞對葡萄糖的攝取和利用，與胰島素抵抗、2型糖尿病的發(fā)生存在一定關系[6-7]。myonectin又稱補體C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白15，是骨骼肌分泌的一種新型生物活性物質[8]，其表達量與血脂、血糖水平顯著相關[9]。本實驗應用高糖高脂、2型糖尿病大鼠模型，觀察高糖高脂下musclin、myonectin mRNA的表達及阿托伐他汀鈣干預對其表達的影響，以探討阿托伐他汀鈣對骨骼肌糖代謝影響的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與飼料 SPF級雄性Wistar大鼠50只，8周齡，體質量180～220 g，動物許可證號：SCXK(魯)20140007,動物合格證號：37009200014560。于動物實驗室適應性喂養(yǎng)1周，飲食、進水自由。動物飼料購于北京博泰宏達生物技術有限公司。

1.2造模、分組及給藥 將50只大鼠隨機分為空白對照組(n=10)、高糖高脂組(n=20)、糖尿病組(n=20)?？瞻讓φ战M大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，高糖高脂組及糖尿病組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，糖尿病組大鼠予鏈脲佐菌素(STZ)40 mg/kg腹腔注射，余2組注射等體積枸櫞酸鹽緩沖液。注射1周后監(jiān)測糖尿病組大鼠空腹血糖(FPG)，F(xiàn)PG≥11.1 mmol/L即造模成功。造模成功后，將高糖高脂組及糖尿病組大鼠分別隨機分為高糖高脂模型組、高糖高脂治療組、糖尿病模型組、糖尿病治療組，每組各10只大鼠。高糖高脂治療組、糖尿病治療組在高糖高脂飼料喂養(yǎng)的同時，給予阿托伐他汀鈣8.4 mg/kg灌胃，余3組使用同等劑量0.9%氯化鈉注射液灌胃，共6周。

1.3骨骼肌標本的采集和處理 6周干預后，所有大鼠禁食、水12 h,于次日分批腹腔注射10%的水合氯醛溶液麻醉，麻醉成功后分離后肢骨骼肌組織，取部分骨骼肌組織迅速放入液氮罐中冷凍，取材完畢統(tǒng)一轉移置-70℃冰箱中保存，用于反轉錄聚合酶鏈式反應檢測。另留取部分骨骼肌組織置于10%福爾馬林液中固定，用于HE染色顯微鏡下形態(tài)學觀察。

1.4myonectin、musclin mRNA實時定量聚合酶鏈式反應檢測 取適量骨骼肌組織樣本加入Trizol 1 ml充分裂解后加入三氯甲烷200 μl，混勻、離心后收集上清，轉移至新1.5 ml EP管中；加入等體積的異丙醇，充分混勻后離心，棄上清；加入75%乙醇，充分混勻離心；倒掉酒精，晾干，加入DEPC 40 μl水溶解RNA。使用超微量核酸蛋白測定儀檢測RNA純度，A260/A280比值為1.8～2.0。采用Aidlab公司生產(chǎn)的反轉錄試劑盒對提取的RNA進行反轉錄，得到cDNA，-80℃保存。以β-actin為內參基因行反轉錄聚合酶鏈式反應，反應條件：95℃ 3 min、95℃ 10 s、60℃ 30 s，共39個循環(huán)。引物信息見表1。以β-actin為內參，利用2-ΔΔCt計算各樣品基因相對表達量。

表1 引物信息

2 結果

2.1各組大鼠光鏡下骨骼肌組織形態(tài)學比較 空白對照組大鼠光鏡下骨骼肌肌纖維大小一致，粗細均勻，未見細胞核內移。模型組、治療組大鼠骨骼肌組織較空白對照組大鼠均出現(xiàn)退行性改變。與空白對照組大鼠相比，高糖高脂模型組及糖尿病模型組大鼠骨骼肌肌纖維大小不一，有核內移，肌纖維分裂。與模型組大鼠相比，高糖高脂治療組及糖尿病治療組大鼠骨骼肌雖有肌纖維大小不一、核內移、肌纖維分裂等變化，但損傷較小，核內移比例較低，肌纖維粗細相對一致。見圖1。

圖1 5組大鼠光鏡下骨骼肌組織形態(tài)學比較(HE×200)

2.2各組大鼠骨骼肌musclin、myonectin mRNA表達水平比較 與空白對照組大鼠相比，高糖高脂模型組和糖尿病模型組大鼠骨骼肌musclin、myonectin mRNA表達水平均顯著上調(P<0.05)；高糖高脂治療組與高糖高脂模型組大鼠相比musclin、myonectin mRNA表達水平明顯降低，但與空白對照組大鼠比較表達水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；糖尿病治療組與糖尿病模型組大鼠比較，musclin、myonectin mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與空白對照組大鼠比較表達水平明顯增高(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠骨骼肌中musclin myonectin mRNA表達水平比較

3 討論

隨著飲食結構的變化，人們日常攝入糖類、脂類物質比例增加，2型糖尿病的患病率逐年上升，成為繼腫瘤和心血管疾病后第三大威脅健康的慢性疾病[10-11]。糖尿病發(fā)病的主要機制為胰島素抵抗和胰島β細胞功能損傷，分子水平方面主要與葡萄糖轉運體及胰島素信號傳導通路相關[12-13]。胰島素抵抗主要發(fā)生在骨骼肌、肝臟和脂肪組織中[14]。骨骼肌作為人體重要的內分泌器官可分泌多種生物活性因子，在預防肥胖、胰島素抵抗和相關疾病(包括2型糖尿病)中起重要作用[15]。

musclin作為肌源性分泌因子與肌肉組織的葡萄糖攝取、脂肪酸代謝、胰島素抵抗狀態(tài)緊密關聯(lián)[16-17]。研究證實，在胰島素誘導分化的C2C12細胞中musclin表達顯著上調[7]。PI3K/AKT途徑是促進葡萄糖轉運蛋白-4(GLUT-4)跨膜轉運重要的胰島素信號傳導通路[18]。musclin能夠下調胰島素誘導大鼠分化的成肌細胞模型中PI3K和AKT/PKB mRNA的表達，減弱GLUT-4活性，從而抑制葡萄糖攝取及糖原合成[19]。AKT/FOXO1信號傳導通路處于胰島素信號傳導通路下游，是調節(jié)糖原合成并維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要途徑，能夠有效改善胰島素抵抗[20]。而FOXO1作為PI3K途徑的下游因子，可下調musclin mRNA的表達[20]。本研究顯示，與空白對照組大鼠相比，糖尿病模型組、高糖高脂模型組大鼠骨骼肌musclin mRNA表達明顯上調，進一步證明musclin可以降低PI3K、AKT/PKB mRNA的表達，抑制GLUT-4活性及細胞對葡萄糖的攝取。而阿托伐他汀鈣則能顯著降低高糖高脂治療組大鼠骨骼肌中musclin mRNA的表達，但對糖尿病治療組無顯著影響，提示阿托伐他汀鈣對糖尿病早期的調節(jié)作用可能是通過抑制musclin的表達以調控胰島素信號傳導通路，來維持葡萄糖和脂肪酸在營養(yǎng)狀態(tài)下的代謝平衡。

myonectin作為一種在骨骼肌中特異性表達的肌源性分泌因子，介導骨骼肌與肝臟、脂肪等器官或組織之間的“對話”，其表達水平受機體營養(yǎng)狀況影響[21]。Seldin等[8]對隔夜禁食小鼠分別用葡萄糖和脂肪乳劑進行灌胃，結果證明二者均能誘導myonectin水平升高。在跑臺運動對高脂飲食大鼠myonectin表達影響的研究中同樣證實，高脂飼養(yǎng)可顯著升高骨骼肌中myonectin mRNA的表達水平，而運動則明顯降低肥胖大鼠骨骼肌中myonectin mRNA的表達水平[9]，提示機體血糖、血脂的升高可促進骨骼肌中myonectin mRNA的表達。相關臨床研究發(fā)現(xiàn)，新發(fā)2型糖尿病患者血漿myonectin水平較正常人顯著升高，且血漿myonectin水平與胰島素抵抗程度呈正相關[22]。本實驗結果表明，高糖高脂狀態(tài)引發(fā)myonectin mRNA表達大幅上升，因此可以推斷myonectin可能作為一種代謝感應因子參與胰島素抵抗，在高糖高脂狀態(tài)下代償性增高。但阿托伐他汀鈣可明顯下調高糖高脂治療組myonectin mRNA的表達，而對糖尿病治療組myonectin mRNA的表達無明顯影響，說明阿托伐他汀鈣能改善糖尿病前期糖脂代謝，這可能是通過對myonectin水平的調控影響胰島素抵抗來實現(xiàn)的。

綜上，糖尿病早期阿托伐他汀鈣可經(jīng)下調musclin、myonectin mRNA表達進一步調控PI3K/AKT通路，改善胰島素抵抗，調節(jié)糖代謝水平。提示臨床應盡早使用阿托伐他汀鈣對糖尿病患者進行干預。