陳譜 阮安民 周俊 張曉哲 王慶甫

桂枝與白芍配伍最早見于《傷寒論》，張仲景在桂枝湯的基礎(chǔ)上，運(yùn)用不同比例的桂枝與白芍，衍化出了小建中湯、桂枝加葛根湯等著名方劑。在前期研究中筆者對(duì)比了不同比例的桂枝與白芍對(duì)骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)中滑膜炎癥的影響，結(jié)果顯示“桂枝—白芍”配伍可以顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥程度[1-2]。然“桂枝—白芍”配伍究竟如何影響到骨關(guān)節(jié)炎，其內(nèi)在作用機(jī)制尚未見報(bào)道。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種利用現(xiàn)有文獻(xiàn)基礎(chǔ)和網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)，從多成分、多靶點(diǎn)以及多通路的角度出發(fā)，構(gòu)建“藥物—成分—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)，探討多種中藥成分與疾病之間的相互作用機(jī)制，比較適合單味中藥及復(fù)方研究的新興學(xué)科[3-4]。因此本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)初步探討“桂枝—白芍”配伍對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 獲取桂枝—白芍藥對(duì)活血成分及潛在治療靶點(diǎn)

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)[5]是一種基于傳統(tǒng)中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)而建立的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)，能捕捉藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系，其內(nèi)包括499味中藥以及29000個(gè)中藥有效成分。藥物成分靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(herb ingredients’ targets，HIT)[6]是一個(gè)包括用于補(bǔ)充美國(guó)食品及藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的藥物的蛋白質(zhì)靶標(biāo)和有潛在治療意義的數(shù)據(jù)庫(kù)，包含大約1301個(gè)已知的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，涵蓋了1300多種著名中草藥中的約586種活性化合物。筆者通過在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索“桂枝”“白芍”，根據(jù)口服利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%以及類藥性(Drug-Likeness,DL)≥0.18進(jìn)行篩選，將得到的生物活血成分進(jìn)行整理并統(tǒng)計(jì)活性成分相對(duì)應(yīng)的靶基因。再將得到的活性成分放入HIT中進(jìn)行檢索，再次收集活性成分相對(duì)應(yīng)的靶基因，使用Excel整理數(shù)據(jù)。

1.2 骨關(guān)節(jié)炎治療靶點(diǎn)獲取

治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(Therapeutic Target Database，TTD)[6]以及Drug Bank數(shù)據(jù)庫(kù)[7]是兩個(gè)常用的包括疾病靶點(diǎn)和藥物信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，既有成功的臨床藥物靶點(diǎn)，亦有在研藥物靶點(diǎn)，其內(nèi)信息均經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，具有較強(qiáng)的可行性。Gene Cards[8]是一個(gè)整和網(wǎng)絡(luò)資源的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，內(nèi)有全面的所有關(guān)于人類的基因注釋信息和預(yù)測(cè)信息，信息較全。筆者在這三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中以“osteoarthritis”為檢索詞，獲取每個(gè)靶點(diǎn)的全稱、簡(jiǎn)稱以及UniProt號(hào)，使用Excel將得到的靶點(diǎn)信息進(jìn)行整和。

1.3 構(gòu)建“藥物—成分—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)

將骨關(guān)節(jié)炎治療靶點(diǎn)與桂枝、白芍藥對(duì)治療靶點(diǎn)用Excel進(jìn)行合并，提取出重復(fù)值，重復(fù)值即為桂枝—白芍藥對(duì)治療OA的靶點(diǎn)。以藥物有效成分和桂枝—白芍藥對(duì)治療OA的靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，在Excel表格中建立關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中建立“桂枝—白芍”與治療靶點(diǎn)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 KEGG通路富集分析

將桂枝—白芍藥對(duì)治療OA的靶點(diǎn)在David網(wǎng)站[9]中進(jìn)行KEGG(京都基因與基因組百科全書)富集，使用R語(yǔ)言對(duì)P值進(jìn)行校正并選擇前20條通路進(jìn)行氣泡圖展示，進(jìn)一步探討桂枝—白芍治療OA過程中的信號(hào)通路。

1.5 GO富集分析

在Cytoscape軟件中下載安裝“BiNGo”以及“MCODE”插件。首先對(duì)桂枝—白芍藥對(duì)治療OA的靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)生物過程富集，包括生物學(xué)過程(BP，Biological Process)、細(xì)胞組分(CC，Cellular Component)、分子功能(MF，Molecular Function)，對(duì)P值進(jìn)行校正后再對(duì)所有具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的GO生物過程進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果

2.1 桂枝—白芍藥對(duì)活血成分及潛在治療靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，以口服利用度(OB)≥30%以及類藥性(DL)≥0.18為篩選條件檢索到7種桂枝有效成分、13種白芍有效成分，且桂枝與白芍之間具有3個(gè)共同有效成分，具體詳見表1～2。將檢索到的有效成分在TCMSP及HIT數(shù)據(jù)庫(kù)上收集相應(yīng)的治療靶點(diǎn)，Excel整理查重后共有90個(gè)治療靶點(diǎn)。

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中桂枝有效成分

表2 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中白芍有效成分

2.2 桂枝白芍治療骨關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)

通過檢索TTD、DrugBank以及GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以分值≥1為篩選條件，Excel整理取出重復(fù)值，共篩選出骨關(guān)節(jié)炎潛在治療靶點(diǎn)1307個(gè)。將桂枝—白芍藥對(duì)治療靶點(diǎn)與骨關(guān)節(jié)炎治療靶點(diǎn)進(jìn)行匹對(duì)，共發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)40個(gè)，詳見表3。

表3 桂枝—白芍藥對(duì)治療骨關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)

續(xù)表3

2.3 “藥物—成分—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)

將桂枝與白芍的每個(gè)有效成分和其相對(duì)應(yīng)治療靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，繪制成分—靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)圖形，以淺黃色為自由度較小的顏色，紅色為自由度較高的顏色。結(jié)果顯示桂枝—白芍藥對(duì)中前五位活血成分一次為MOL000358(β-谷甾醇)、MOL000422(山柰酚)、MOL000359(谷甾醇)、MOL000492(兒茶酸)、MOL004576(黃杉素)，詳見圖1。

注：圖中方形代表藥物成分，圓形代表靶點(diǎn)

2.4 KEGG通路富集分析

將關(guān)鍵靶基因在David網(wǎng)站中進(jìn)行KEGG通路富集，共富集出通路93條，使用R語(yǔ)言對(duì)P值進(jìn)行校正并選擇前20條通路進(jìn)行氣泡圖展示，見圖2。結(jié)果顯示桂枝—白芍藥對(duì)治療OA的信號(hào)通路包括癌癥、乙型肝炎、腫瘤壞死因子等通路，還包括細(xì)胞凋亡、結(jié)直腸癌、Toll樣受體等信號(hào)通路。

圖2 KEGG通路富集分析

2.5 GO富集分析

將獲得的關(guān)鍵靶基因放入David網(wǎng)站上進(jìn)行GO富集分析，選擇生物學(xué)過程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)以及細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)三個(gè)內(nèi)容。分析結(jié)果如圖3～5所示，桂枝白芍的靶點(diǎn)在BP上主要是在藥物反應(yīng)、雌二醇、衰老以及激活NF-κB信號(hào)通路等；在MF上主要表現(xiàn)為類固醇激素受體活性、單氧酶活動(dòng)以及過氧化物酶活性；在CC上主要位于胞質(zhì)、膜筏及細(xì)胞器膜上。

圖3 GO富集分析—生物學(xué)過程(BP)

圖4 GO富集分析—分子功能(MF)

圖5 GO富集分析—細(xì)胞組分(CC)

3 討論

OA是一種以滑膜炎癥、軟骨進(jìn)行性退變并累計(jì)關(guān)節(jié)軟骨下骨的退行性肌肉骨骼疾病，其主要癥狀有關(guān)節(jié)疼痛、僵硬以及功能障礙[10-12]。國(guó)際衛(wèi)生組織發(fā)布的流行病學(xué)顯示OA是全世界十大致殘?jiān)蛑籟10]，隨著中國(guó)逐步步入老齡化社會(huì)，中國(guó)OA患者也呈逐年增加的趨勢(shì)。雖然治療OA的方法眾多，然目前仍無(wú)一種方法可以逆轉(zhuǎn)或者暫止OA的發(fā)生與發(fā)展[12-15]。因此研究OA的發(fā)病機(jī)理，探索治療OA的作用機(jī)制具有重要社會(huì)意義。

“桂枝—白芍”是中醫(yī)學(xué)常見的配對(duì)用藥之一，桂枝辛散調(diào)衛(wèi)陽(yáng)，白芍酸澀和營(yíng)陰，桂芍配伍可調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、溫經(jīng)和血。張仲景即在黃芪桂枝五味湯中連用桂芍，取其調(diào)營(yíng)衛(wèi)、治陰陽(yáng)以治陰陽(yáng)舉微之血痹?，F(xiàn)代藥理學(xué)顯示，桂枝中的有效單體桂皮醛具有顯著的抑制炎癥、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗糖尿病等作用[16-18]；白芍的提取物白芍總苷可以抗炎止痛、調(diào)節(jié)免疫[19-22]。筆者團(tuán)隊(duì)在傳承經(jīng)典的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)證據(jù)，以“桂枝—白芍”為君藥組方通絡(luò)止痛方，取其抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫之效用于治療OA，取得顯著效果。在北京市科委和國(guó)自然的資助下，團(tuán)隊(duì)在不同層面上對(duì)通絡(luò)止痛方上治療OA的療效進(jìn)行了驗(yàn)證[1-2，23-24，26-29]。在細(xì)胞層面上，通絡(luò)止痛方可以顯著抑制滑膜細(xì)胞炎癥，其中君藥有效成分可以抑制滑膜細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，且桂枝白芍聯(lián)合用藥效果顯著高于單味組[22，25，27]；在動(dòng)物層面上，低頻超聲促透通絡(luò)止痛方可以顯著抑制大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎骨關(guān)節(jié)炎中的炎性因子表達(dá)[28-29]；在臨床研究上，超聲電導(dǎo)通絡(luò)止痛方可以顯著降低早期膝骨關(guān)節(jié)炎患者疼痛評(píng)分并提高患肢功能[25]。然而通絡(luò)止痛方如何治療OA，君藥“桂枝—白芍”通過哪些信號(hào)通路影響到OA，目前暫不清楚。

本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)出發(fā)，探討“桂枝—白芍”藥對(duì)治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在治療機(jī)制。本次研究在“桂枝—白芍”藥對(duì)中共檢索出17種有效治療成分，映射治療OA靶標(biāo)40個(gè)。在“藥物—成分—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)有5種有效成分最為顯著，即β-谷甾醇、山柰酚、谷甾醇、兒茶酸和黃杉素，而其中有3種有效成分同時(shí)存在于桂枝與白芍之中，這可能是“桂枝—白芍”聯(lián)合用藥效果更佳的潛在原因。KEGG通路富集分析顯示其潛在治療可能與癌癥、乙型肝炎、腫瘤壞死因子通路有關(guān)，在這些通路中MAPK、Jak/STAT、ERK、NF-κB以及自噬等經(jīng)典通路相互交聯(lián)。GO富集分析顯示“桂枝—白芍”在生物學(xué)過程中主要是激活藥物反應(yīng)應(yīng)答、衰老、抗氧化以及調(diào)節(jié)NF-κB通路、ERK信號(hào)通路等；在分子功能上主要是激活類固醇激素受體與過氧化物酶活性，這與KEGG結(jié)果顯示相符，也與之前文獻(xiàn)報(bào)道相吻合。

綜上所述，本研究以經(jīng)典藥對(duì)“桂枝—白芍”為研究對(duì)象，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)，探討了“桂枝—白芍”藥對(duì)所包含的有效成分以及治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路，構(gòu)建藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行KEGG和GO富集分析，闡述了“桂枝—白芍”治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究“桂枝—白芍”藥對(duì)作用提供了參考。