嚴雅慧，李淑萍，熱依木古麗·阿布都拉，阿吉艾克拜爾·艾薩*

1中國科學院大學，北京 100049；2中國科學院干旱區(qū)植物資源化學重點實驗室中國科學院新疆理化技術(shù)研究所，烏魯木齊 830011

蘆薈為重要的可食用的藥材，是百合科蘆薈屬多年生常綠肉質(zhì)草本植物，性寒味苦，古方中記載其具有清肝熱、通便、散結(jié)、療癬等作用。蘆薈總共有500多個品種，其中庫拉索蘆薈(Aloevera(L.) Burm.f.)是最常用的藥用品種，其制品也廣泛應用于食品(包含保健食品)、藥品、化妝品等多個領(lǐng)域[1]。近年來，國內(nèi)外蘆薈的研究工作主要集中在品種的對比分析[2,3]、分離純化[4,5]、質(zhì)譜分析[6,7]、含量測定[8,9]和藥理作用[10,11]等方面。研究證明，蘆薈的主要活性成分為蒽酮類、蒽醌類和色酮類化合物，此外還有多糖類及糖苷、氨基酸、有機酸等化學成分[12,13]，具有抑菌、消炎、抗腫瘤、抗病毒、抗過敏等活性[14-16]。

目前，指紋圖譜結(jié)合化學模式識別是評價中藥材質(zhì)量的有效手段。指紋圖譜主要關(guān)注藥材的整體性，建立共有模式，識別共有峰，能夠客觀、全面揭示藥材中可能的活性成分種類和數(shù)量；而化學模式識別技術(shù)則強調(diào)的是藥材之間差異性，通過對指紋圖譜數(shù)據(jù)信息的整合和校正，進一步縮小藥材活性成分的范圍；兩者結(jié)合可實現(xiàn)藥材的整體描述到個體分析的過程，可更加準確、客觀地反映中藥的質(zhì)量差異[17,18]。蘆薈藥材主要藥用成分以蘆薈苷、蘆薈大黃素等化合物為主[19]，但功效成分及其含量隨藥材產(chǎn)地、生長環(huán)境、土壤及采摘季節(jié)等因素而不同，給蘆薈藥材品質(zhì)及安全性的評價帶來了一定的困難。此外，《中國藥典》(2020版)[20]中蘆薈藥材的含量測定項目以蘆薈苷含量來制定，指標成分單一，難以控制藥材質(zhì)量。因此，在生產(chǎn)和開發(fā)蘆薈藥材相關(guān)制劑之前，對蘆薈藥材進行指紋圖譜和結(jié)合化學模式識別研究是必不可少的。

本研究采用高效液相色譜(HPLC)法建立12批次不同產(chǎn)地的蘆薈藥材的指紋圖譜，并結(jié)合相似度分析、聚類分析、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)研究其化學組分特征，篩選出能影響藥材質(zhì)量差異的標志物，并用相同的方法測定12批蘆薈藥材中6個標志物(蘆薈新苷D、蘆薈苷A、蘆薈苷B、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苦素和蘆薈大黃素)的含量，旨在從生產(chǎn)源頭確保藥材品質(zhì)，為蘆薈藥材質(zhì)量控制和標準完善提供科學依據(jù)。

1 實驗儀器與材料

1.1 儀器

美國Water 2695液相色譜儀(包括自動進樣器，DAD紫外檢測器；Empower色譜工作站，四元梯度泵，在線過濾器，柱溫箱);BT25S型電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);SQP型電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);SK7210 HP型超聲波(上海科導超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

對照品：蘆薈苦素(批號：19011601)、蘆薈新苷D(批號：19091701)、蘆薈苷B(批號：19030501)、蘆薈苷A(批號：19030204)、蘆薈大黃素(批號：19010803)、7-O-甲基蘆薈新甙A(批號：19101301)均采購于上海純優(yōu)生物科技有限公司，以上對照品純度均 ≥ 97.5%。

甲醇和乙腈均為色譜純(Merck公司，Darmstadt，德國)；磷酸和甲醇為分析純(天津市光復精細化工研究所)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；其他所有試劑均為分析純。

12批蘆薈藥材來源于廣東、廣西、海南和四川4個省份，其中S1、S2、S7來源于四川省，S10～S12來源于廣西省，S3～S5來源于廣東省，S6、S8、S9來源于海南省。經(jīng)中國科學院新疆理化技術(shù)研究所劉戈宇研究員鑒定為庫拉索蘆薈Aloevera(L.) Burm.f.的濃縮物。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜建立

2.1.1 樣品制備

參照中國藥典方法[25]略微改動，取蘆薈藥材粉末(過5號篩)50 mg，精密稱定，精密加入50%甲醇75 mL，稱定重量，超聲處理(40 kH，700 W，25 ℃)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇水補足減失的重量，搖勻，分析前過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取各對照品適量，精密稱定，置于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成對照溶液：蘆薈苦素(316 μg/mL)、蘆薈新苷D(524 μg/mL)、7-O-甲基蘆薈新甙A(228 μg/mL)、蘆薈苷B(508 μg/mL)、蘆薈苷A(506 μg/mL)、蘆薈大黃素(436 μg/mL)，精密量取各對照溶液按一定比例混合配制成不同濃度的6份混合對照溶液，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜備用，-20 ℃避光保存。

2.1.3 色譜條件

HPLC色譜柱：Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex Inc.，CA，USA)，流動相溶劑A：0.3%(V/V)磷酸水溶液，B：乙腈，C：甲醇，流速是1 mL/min，進樣10 μL，柱溫35 ℃，檢測波長為254 nm，最佳梯度洗脫如下：0～8 min，88%A+10%B+2%C；8～10 min，74%A+10%B+16%C；10～45 min，58%A+10%B+32%C；45～80 min，55% A+10%B+35%C。

2.2 指紋圖譜的方法學考察

2.2.1 精密度

取編號S1的樣品，按“2.1.1”項下處理，按“2.1.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄液相色譜圖。以15號色譜峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD<0.19%，相對峰面積的RSD<0.89%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性

取編號S1的樣品，按“2.1.1”項下處理，按“2.1.3”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、18、24、48 h進樣，記錄液相色譜圖。以15號色譜峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD<0.87%，相對峰面積的RSD<2.67%(n=8)，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復性

取編號S1的樣品，精密稱取6份，按“2.1.1”項下處理，按“2.1.3”項下色譜條件進行測定，記錄液相色譜圖。以15號色譜峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD<0.42%，相對峰面積的RSD<2.66%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3 指紋圖譜的生成

12批蘆薈藥材按“2.1.1”方法制備，再按“2.1.3”色譜條件進樣測定，記錄液相色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 A版)》，以S1為參照圖譜，采用中位數(shù)法、時間窗寬度設(shè)為0.1 min建立對照圖譜，用多點校正Mark峰匹配，建立12批蘆薈藥材樣品的指紋圖譜。疊加指紋圖譜、參照圖以及共有峰標記均見圖1。

圖1 12批蘆薈藥材的指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 12 batches of aloe

圖2 蘆薈樣品(a)和混合對照品溶液(b)HPLC 圖Fig.2 HPLC chromatograms of sample (a) of aloe and mixed reference substances (b)注：1：蘆薈苦素；2：蘆薈新苷D；3：7-O-甲基蘆薈新甙A；4：蘆薈苷B；5：蘆薈苷A；6：蘆薈大黃素。Note:1:Aloesin;2:Aloeresin D;3:7-O-Methylaloeresin A;4:Aloin B;5:Aloin A;6:Aloe-emodin.

2.3.1 共有峰的指認

從12批蘆薈藥材中標定了23個共有峰，通過與對照品比對，指認出6個成分，分別是3號峰為蘆薈苦素、12號峰為蘆薈新苷D、13號峰為7-O-甲基蘆薈新甙A、14號峰為蘆薈苷B、15號峰為蘆薈苷A、23號峰為蘆薈大黃素。蘆薈樣品和混合對照品的HPLC圖譜見圖2。結(jié)果表明12批蘆薈藥材中23個共有峰的相對保留時間RSD為0%～0.55%，相對峰面積RSD為16.54%～97.02%，表明方法穩(wěn)定，但不同產(chǎn)地的蘆薈藥材中成分含量差異較大。

2.3.2 相似度分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 A版)》軟件建立12批蘆薈藥材共有模式的指紋圖譜，其相似度評價見表1。除產(chǎn)地是廣西的S10～S12樣品相似度小于0.5外，其余樣品的相似度均>0.93。

表1 12批蘆薈藥材指紋圖譜的相似度評價表

圖3 12批蘆薈藥材的聚類分析樹狀圖 Fig.3 Hierarchical cluster analysis plot for 12 batches of aloe

2.4 化學模式識別分析

2.4.1 聚類分析

以12批蘆薈藥材中23個共有峰的峰面積為變量，運用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件，以組間聯(lián)接平方歐式距離測度的方式進行聚類分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，12批蘆薈藥材樣品明顯聚為三類，S1、S2、S7聚為第一類，S10～S12聚為第二類，S3～S6、S8、S9聚為第三類。

2.4.2 主成分分析(PCA)

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件對12批蘆薈藥材中23個共有峰的峰面積進行標準化處理，計算相關(guān)矩陣的特征值即方差貢獻率，以特征值>1為標準，得到了前4個主成分的累積方差貢獻率為87.593%，能夠較好的代表指紋圖譜中的大部分信息。從成分載荷矩陣表可以看出，第一主成分的獨立方差貢獻率為39.529%，主要反映色譜峰7～9、11～15、17、18、22的信息；第二主成分的獨立方差貢獻率為26.749%，主要反映色譜峰1、2、4、6、10、16、19、21、23的信息；第三主成分的獨立方差貢獻率為14.833%，主要反映色譜峰3、20的信息；第四主成分的獨立方差貢獻率為6.482%，主要反映色譜峰 5的信息。利用SIMCA 14.1分析軟件繪制主成分得分圖，見圖4。結(jié)果表明12批蘆薈藥材大致可被分為三類，S1、S2、S7在主成分得分圖的中間分為第一類；S10～S12在主成分得分圖的左側(cè)分為第二類，S3～S6、S8、S9在主成分得分圖的右側(cè)分為第三類，其結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，也驗證了聚類分析的分類結(jié)果。

圖4 主成分分析得分圖Fig.4 Score scatter plot of PCA

2.4.3 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)

正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)是常用來處理分類和判別問題的一種非常有效的監(jiān)督分析方法。而OPLS-DA模型的擬合效果評價指標主要是累積解釋能力參數(shù)(R2X、R2Y)和預測能力參數(shù)(Q2)，如果R2X、R2Y和Q2均大于0.5，且數(shù)值越接近于1，則表示模型擬合效果越好[17]。采用SMICA 14.1軟件對12批蘆薈藥材共有峰進行OPLS-DA分析，擬合的模型R2X=0.929，R2Y=0.939，Q2=0.835，均大于0.8，表示擬合的預測模型穩(wěn)定、可靠，可用來評價蘆薈藥材指紋圖譜的模式識別方法，其得分散點圖見圖5。由圖5可知，廣西和四川產(chǎn)區(qū)的樣品各自聚為一類；廣東和海南產(chǎn)區(qū)的樣品聚為一類，說明這兩個產(chǎn)區(qū)藥材的化學成分相似性很高。以變量投影重要性(VIP)值大于1為依據(jù)，篩選對分組結(jié)果產(chǎn)生較大影響的色譜峰，結(jié)果見圖6。由圖6可知，VIP值大于1的色譜峰從大到小分別為12號峰(蘆薈新苷D，VIP值為2.982 3)、15號峰(蘆薈苷A，VIP值為1.971 5)、13號峰(7-O-甲基蘆薈新甙A，VIP值為1.691 5)、14號峰(蘆薈苷B，VIP值為1.540 1)、3號峰(蘆薈苦素，VIP值為1.523 5)，表明這5個化合物是影響蘆薈藥材質(zhì)量差異的標志物。

圖5 OPLS-DA得分散點圖Fig.5 Score scatter plot of OPLS-DA

圖6 12批蘆薈藥材OPLS-DA模型中共有峰的VIP值Fig.6 VIP values of common peaks in OPLS-DA model of 12 batches of aloe

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件、樣品溶液制備和混合對照品溶液制備

同“2.1”一致，樣品和混合對照品見圖2。

2.5.2 線性關(guān)系、檢測限和定量限

分別精密吸取“2.1.2”項下6個對照品貯備液適量，混合，加甲醇定容、稀釋，制成一系列不同濃度的混合對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行回歸分析，結(jié)果見表2。分別精密吸取對照品溶液適量，加甲醇稀釋，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果表明，蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷 B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的標準曲線在其各自的線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均≥0.999 5，檢測限范圍在0.017 4～0.314 0 μg/mL，定量限范圍在0.034 9～0.559 0 μg/mL，結(jié)果見表2。

2.5.3 精密度、穩(wěn)定性、重復性和回收率

精密度試驗：取樣品(S1)，按“2.1.1”方法制備樣品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素峰面積的RSD分別為0.69%、0.75%、0.64%、1.22%、0.99%、1.13%(n=6)，表明儀器精密度良好。

表2 6個指標成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限

穩(wěn)定性試驗：取樣品(S1)，按“2.1.1”方法制備樣品溶液，置于室溫儲存，按“2.1.3”色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24、48 h進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素峰面積的RSD分別為1.92%、2.59%、2.73%、2.93%、2.46%、2.15%(n=8)，表明蘆薈樣品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取樣品(S1)，精密稱取6份，按“2.1.1”方法制備樣品溶液，按“2.1.3”色譜條件進樣測定，記錄峰面積計算樣品含量。結(jié)果顯示，蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素平均含量分別為8.42、167.28、18.62、109.60、191.91、24.02 mg/g，含量的RSD分別為0.88%、0.72%、2.13%、1.30%、1.48%、1.95%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收率試驗：取樣品(S1)藥材粉末(過5號篩)25 mg，按照樣品中蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的含有量與混合對照品比例1∶1精密加入，后續(xù)處理同“2.1.1”項。按“2.1.3”色譜條件進行測定，計算回收率。蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的平均加樣回收率分別為99.00%、91.45%、97.93%、94.70%、96.41%、95.34%，其RSD值分別為1.16%、0.86%、0.98%、1.13%、1.22%、1.94%(n=6)品的回收率良好，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率結(jié)果(n=6)

續(xù)表3

2.5.4 樣品含量測定

采用“2.1.3”項下的色譜方法，測定了12批蘆薈藥材中蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的含量，每個樣品做3個平行，結(jié)果見表4。

由表4可知，廣東、海南和四川產(chǎn)區(qū)的6個指標成分總含量達到519.87～688.87 mg/g以上，而廣西產(chǎn)區(qū)僅達到371.31～442.73 mg/g。12批藥材中6個指標成分含量對比，蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A的相對含量差異較大，分別為0.55～13.47、7.98～369.88、1.36～25.44 mg/g；蘆薈苷B、A和蘆薈大黃素的含量差異相對較小，含量分別為65.14～150.08、109.51～263.16、18.30～40.32 mg/g。其中廣西產(chǎn)區(qū)的樣品，蘆薈新苷D的平均含量(9.70 mg/g)遠低于廣東產(chǎn)區(qū)(293.97 mg/g)、海南產(chǎn)區(qū)(293.57 mg/g)和四川產(chǎn)區(qū)(257.81 mg/g)的平均值，但蘆薈苷B(142.58 mg/g)和A(237.08 mg/g)的平均含量均高于廣東產(chǎn)區(qū)(110.21、195.79 mg/g)、海南產(chǎn)區(qū)(102.80、179.87 mg/g)和四川產(chǎn)區(qū)(97.17、170.48mg/g)的平均值。

3 討論

本研究比較了熱回流法和超聲法對特征色譜峰提取率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲處理提取效率高、時間短、損失少，易操作。同時分別考察了提取溶劑(甲醇、乙醇)及濃度、提取時間和液料比對蘆薈藥材中6個指標成分提取率的影響，結(jié)果顯示，50%甲醇水溶液75 mL超聲提取20 min為最佳?？疾炝艘译?甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液和甲醇-磷酸水等流動相體系。結(jié)果表明，當以甲醇-乙腈-0.3%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫時，各指標成分峰型對稱、分離度較好，運行時間短，效果最佳。比較了不同檢測波長(254、280、310、330、360 nm)下各色譜峰的峰形和分離度，結(jié)果顯示，254 nm處6個指標成分吸收強度高，基線平穩(wěn)、分離度良好，故選擇254 nm為檢測波長。

表4 12批蘆薈樣品6個指標成分的含量

12批蘆薈藥材的指紋圖譜共識別23個共有峰，從相似度結(jié)果可知，除廣西產(chǎn)區(qū)的相似度低于0.5外，其他均大于0.93，說明市售的蘆薈藥材因產(chǎn)地不同，其化學成分種類和含量有很大差異。從聚類分析結(jié)果可知，12批蘆薈藥材聚為3類，與主成分分析結(jié)果一致。利用正交偏最小二乘判別法篩選出影響蘆薈藥材質(zhì)量差異的5個色譜峰，并以相同HPLC法對其進行含量測定。因蘆薈大黃素也是蘆薈藥材中主要的生物活性化合物之一[21]，固也列入含量測定的指標性成分，其分析結(jié)果可知6個指標成分含量存在較大差異。這種差異可能是由于地理環(huán)境、氣候條件、采收期、土壤及田間管理、種植模式等諸多因素，對藥材次生代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生影響，從而導致藥材相似度以及含量的差異性[22]；其次蘆薈藥材是以濃縮物的性狀呈現(xiàn)，其濃縮方式、烘干工藝、取材部位等也會使藥材的化學成分有很大差異。

本研究采用定量指紋圖譜結(jié)合化學模式多元判別方法對不同產(chǎn)地的蘆薈藥材成分差異進行分析，并對6個指標成分進行了含量測定，可直觀評價各產(chǎn)地蘆薈藥材品質(zhì)的一致性，還同時體現(xiàn)化學成分的差異性，為蘆薈藥材的質(zhì)量控制和后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供科學參考。