吳國琳，王 慶，盧雯雯，熊福林，高 麗，卞 華*

1浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，杭州 310003；2浙江省立同德醫(yī)院，杭州 310012；3南陽理工學院 河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室，南陽 473004

干燥綜合征(sjogren’s syndrome，SS)是一種常見的風濕免疫性疾病，多發(fā)生于中青年女性，其發(fā)病率列風濕免疫性疾病第二位。常見臨床癥狀為口干、眼干、關(guān)節(jié)疼痛、乏力等，嚴重者可影響生活質(zhì)量。目前SS尚無確切的病因和發(fā)病機制，一般認為是在遺傳、病毒感染和性激素異常等多種因素作用下，導(dǎo)致機體免疫功能異常，通過多種細胞因子和炎癥介質(zhì)造成淋巴細胞侵犯唾液腺和淚腺等外分泌腺而發(fā)病[1]。有研究證實T輔助細胞17(Thl7)/Treg細胞偏移及其免疫失衡與SS發(fā)病密切相關(guān)，而Th17/Treg之間的動態(tài)平衡可通過其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤獨受體γt(retinoidrelated orphan receptor，RORγt)/叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead transcription factor 3，F(xiàn)oxp3)介導(dǎo)[2]。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是從中藥白芍中提取的一種糖苷類物質(zhì)，是白芍的主要化學成分[3]，在臨床應(yīng)用治療SS能改善患者口干、眼干等癥狀，有較好臨床療效，且安全性較高[4]。本實驗旨在通過研究白芍總苷對SS模型小鼠頜下腺Th17、Treg細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR γt mRNA、FoxP3 mRNA的表達水平的影響，探討白芍總苷治療SS的可能作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選擇8周齡的雌性非肥胖型糖尿病(non obese diabetes，NOD)小鼠24只，SPF級，購自上海斯萊克動物實驗中心，合格證號：20130016000707。在無菌的恒定溫度和濕度條件下飼養(yǎng)。實驗方案經(jīng)浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批通過(批件號(2018)實動快審第(048)號)。

1.2 實驗藥物

白芍總苷膠囊(寧波立華制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格0.3 g/粒，批號20180718)用蒸餾水稀釋成含生藥量15 g/mL。硫酸羥氯喹片(由上海中西制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.1 g/片，批號：180812)，用蒸餾水稀釋成含生藥量3 mg/mL。

1.3 實驗試劑

實驗用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)；兔抗鼠RORγt、FoxP3多克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司生產(chǎn))；RORγt、FoxP3原位雜交檢測試劑盒(武漢博士德公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組及給藥

將24只NOD小鼠隨機分為4組，即模型組、白芍總苷組、羥氯喹組以及聯(lián)合組，每組各6只，另外選6只BALB/c小鼠為正常對照組。每組小鼠的給藥量按動物與人等效劑量換算表計算。

白芍總苷組每日定時按照300 mg/kg劑量分別灌胃TGP稀釋液0.4 mL，羥氯喹組每日按60 mg/kg劑量灌胃硫酸羥氯喹稀釋液0.4 mL,聯(lián)合組每日灌胃TGP 0.4 mL+羥氯喹0.4 mL。模型組和正常組灌胃等體積的生理鹽水0.4 mL。

2.2 指標檢測

各組小鼠在喂養(yǎng)并給藥8周后，頸椎脫臼處死后，立即摘取雙側(cè)頜下腺組織進行指標檢測。觀察及檢測指標如下。

2.2.1 頜下腺組織病理觀察

將摘取的小鼠頜下腺組織放置于4%多聚甲醛中固定，然后包埋、切片、HE染色后，在光鏡下觀察組織的病理變化，分析各組小鼠頜下腺的淋巴細胞浸潤程度，并根據(jù)Chisholm- Mason組織學評分方法將各組小鼠頜下腺病變輕重程度進行量化分析，評價標準見表1。

2.2.2 RT-PCR法檢測頜下腺組織RORγt mRNA、FoxP3 mRNA的表達

2.2.2.1 檢測步驟

以GAPDH為內(nèi)參，用Trisol試劑盒提取頜下腺總RNA，然后取1 μL進行RT-PCR分析。GAPDH引物序列：上游5′-AAGGGTGGAGCCAAAAGGG-3，下游5′-TGGGGGTAGGA ACACGGAA-3；RORγt引物序列：上游5′-AAGCAGGAGCAATGGAAGTCG-3，下游5′- GAGAACCAGGGCCGTGTAGAG-3；FoxP3引物序列為：5′-GAGAAAGCGGATACCA AATGA -3，下游5′-GAGACAGAGATGGGCAAGAAG-3。本實驗PCR反應(yīng)參數(shù)為94 ℃ 5 min，再將反應(yīng)條件變?yōu)?4 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，然后循環(huán)擴增40次，于60 ℃檢測熒光值。RORγt mRNA、FoxP3 mRNA及內(nèi)參GAPDH分別在兩個管中同時進行PCR反應(yīng)，除探針和引物外，兩管中加入的RNA模板和其他反應(yīng)試劑均一致。

表1 SS模型小鼠頜下腺病理學評價標準

2.2.2.2 結(jié)果判斷

通過ABI Stepone plus熒光定量PCR儀測定并取其循環(huán)閾值均值(CT值)，結(jié)果采用相對定量分析法，即2-△△CT法進行mRNA相對表達量的計算，以各組△CT值進行統(tǒng)計學分析，本實驗以模型組做為未處理組，與其他各組進行比較。具體計算公式如下：

△CT=目的基因CT值(實驗組)-該組內(nèi)參基因CT值

△△CT=(目的基因CT值—內(nèi)參基因CT值)實驗組-(目的基因CT值—內(nèi)參基因CT值)模型組

△CT值越小表示RORγt mRNA、FoxP3 mRNA在頜下腺組織中的表達越高，而2-△△CT值越高，表明樣本中RORγt mRNA、FoxP3 mRNA相對于模型組表達量越大。

2.3 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

實驗過程中，模型組和羥氯喹組各有1只小鼠死亡，經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)是因灌胃不當損傷食管引起。

3.1 各組小鼠頜下腺組織形態(tài)學觀察

3.1.1 光鏡下頜下腺病理觀察

頜下腺病理觀察顯示(見圖1)，正常組頜下腺腺泡大小基本均一，腺泡及導(dǎo)管結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)中未見淋巴細胞浸潤。模型組頜下腺腺泡大小不等，部分有破壞，間質(zhì)有中度或重度淋巴細胞浸潤，可見局部腺體萎縮及纖維組織增生。白芍總苷組、羥氯喹組以及聯(lián)合組小鼠頜下腺病理顯示腺泡大小不一，可見少量腺泡和導(dǎo)管結(jié)構(gòu)破壞，有散在的單個淋巴細胞浸潤，且聯(lián)合組少于白芍總苷組和羥氯喹組。

圖1 各組小鼠頜下腺病理(HE 10×40)Fig.1 Submandibular gland pathology of mice in each group(HE 10×40)注：A：正常組；B：模型組；C：羥氯喹組；D：白芍總苷組；E：聯(lián)合組。Note:A:The normal group;B:Model group;C:HCQ group;D:TGP group;E:Combined group.

3.1.2 各組小鼠頜下腺組織病理評分比較

表2 各組頜下腺組織病理評分比較

病理評分顯示(見表2)，正常組小鼠頜下腺組織病理評分顯著低于其他實驗組(P<0.05)，模型組小鼠頜下腺組織病理評分明顯高于其他組，統(tǒng)計有顯著性差異(P<0.05)。聯(lián)合組低于白芍總苷組和羥氯喹組，統(tǒng)計具有顯著性差異(P<0.05)。

3.2 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的表達比較

3.2.1 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對表達量△CT比較

由表3中可以看出，正常組小鼠頜下腺組織RORγt mRNA的△CT值顯著低于其他實驗組，模型組高于其他各組，且與正常組和聯(lián)合組相比有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)，而聯(lián)合組低于模型組、羥氯喹組和白芍總苷組，統(tǒng)計有顯著性差異(P<0.05)。

表3 各組頜下腺RORγt mRNA、Foxp 3 mRNA表達量△CT比較

各組小鼠頜下腺組織Foxp3 mRNA的△CT值比較發(fā)現(xiàn)，模型組明顯低于其他組，且與正常組和聯(lián)合組相比統(tǒng)計具有顯著性差異(P<0.05)，聯(lián)合組雖然高于羥氯喹組和白芍總苷組，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3.2.2 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對表達量2-△△CT值比較

從圖2中看出，各組小鼠頜下腺組織RORγt mRNA表達量的2-△△CT值從高到低一次為：模型組>羥氯喹組>白芍總苷組>聯(lián)合組>正常組；各組小鼠頜下腺組織FoxP3 mRNA表達量的2-△△CT值從高到低依次為：正常組>聯(lián)合組>白芍總苷組>羥氯喹組>模型組。

4 討論

SS的病因和發(fā)病機制雖然不明，但與機體自身免疫耐受被打破導(dǎo)致免疫穩(wěn)態(tài)失衡有重要關(guān)系。近年來，輔助性T細胞(Th)的分化及其免疫平衡在SS發(fā)病中的作用逐漸受到關(guān)注，一般認為，Th17/Treg之間的動態(tài)平衡對維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用，若此種平衡失調(diào)可引起全身或局部免疫應(yīng)答異常，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。輔助性T細胞的分化方向取決于調(diào)控其分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究證實，RORγt的表達激活促進前體細胞分化為Thl7細胞，是Th17細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，維持Thl7細胞的分泌功能，對致病性Thl7細胞的分化起關(guān)鍵性作用。而Foxp3是控制Treg細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)pSS患者唇腺中Foxp3 mRNA表達降低，F(xiàn)oxp3參與了pSS的發(fā)病[5]。在SS的發(fā)病過程中，Thl7效應(yīng)增強可能促進SS的發(fā)展及惡化，而調(diào)節(jié)性Treg細胞可抑制過度亢進的Thl7，以維持機體免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)，但Thl7/Treg免疫失衡可能促發(fā)或加劇SS的發(fā)生發(fā)展[6]，提示轉(zhuǎn)錄因子RORγt/FoxP3介導(dǎo)Thl7/ Treg之間的免疫平衡與SS發(fā)病密切相關(guān)。

圖2 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對表達量2-△△CT值Fig.2 Relative expression levels of RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in submandibular glands of mice in each group 2-△△CT values

目前SS無有效治療方法，治療目標是緩解癥狀和預(yù)防并發(fā)癥。而中西藥協(xié)同治療SS可有助于緩解SS患者口干、眼干、乏力、關(guān)節(jié)痛等癥狀，促進淚腺和唾液分泌功能，提高患者生活質(zhì)量，避免西藥不良反應(yīng)，減少復(fù)發(fā)率，其優(yōu)勢已被廣泛認可[7]。TGP治療SS有明顯的臨床療效，TGP聯(lián)合HCQ治療pSS效果顯著，且副作用較少[8]。

NOD小鼠是目前最為理想的干燥綜合征實驗動物模型,廣泛應(yīng)用于SS的發(fā)病機制及療效研究[9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白芍總苷能減輕NOD小鼠頜下腺淋巴細胞灶性浸潤程度，可預(yù)防自發(fā)性涎腺炎的發(fā)生[10]，也能促進NOD小鼠頜下腺水分子通道蛋白-5(AQP-5)的表達，改善口干多飲等癥狀，并能調(diào)節(jié)小鼠血清及頜下腺組織的Thl/Th2型細胞因子表達[11,12]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組NOD小鼠頜下腺病理損害明顯較正常組嚴重，經(jīng)藥物干預(yù)后均得到不同程度的改善，且聯(lián)合組明顯優(yōu)于單純羥氯喹組和白芍總苷組。同時發(fā)現(xiàn)，模型組NOD小鼠頜下腺RORγt mRNA的表達明顯高于正常組，而Foxp3 mRNA的表達明顯低于正常組，經(jīng)藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組能明顯降低頜下腺RORγt mRNA的表達，最接近于正常組，效果優(yōu)于羥氯喹組和白芍總苷組。聯(lián)合組頜下腺Foxp3 mRNA的表達低于模型組、羥氯喹組和白芍總苷組，且與模型組相比有顯著性差異。實驗結(jié)果表明，白芍總苷能改善干燥綜合征NOD小鼠頜下腺的病理損害，并能有效下調(diào)RORγt mRNA的表達，上調(diào)Foxp3 mRNA的表達，由此我們推測，白芍總苷可能通過調(diào)節(jié)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子RORγtmRNA、FoxP3mRNA的表達，從而調(diào)節(jié)其相應(yīng)介導(dǎo)的Thl7/Treg之間的免疫平衡而起到治療SS的作用，將為今后進一步深入研究白芍總苷的免疫調(diào)節(jié)機制提供新思路。