劉 娜，夏咸松，趙 毅，蘇劉艷，孫金瑞

(云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

草果(Amomumtsaoko)是姜科豆蔻屬植物的干燥成熟果實(shí)，成熟時(shí)紅色，種子呈多角形，香味濃郁；其果實(shí)能入藥，味辛、性溫，入脾、胃二經(jīng)，燥濕溫中，除痰截瘧；主治脘腹脹滿，反胃嘔吐，食積瘧疾等癥[1-3].草果作為調(diào)味香料在我國云南、廣西、四川和貴州等地均有種植，作為經(jīng)濟(jì)作物且屬于藥食同源的中藥材，其發(fā)展越來越受到云南省多個(gè)地區(qū)的重視[4-6]，但是目前90%以上的草果用于食品添加[7-8]，只有不到5%的產(chǎn)量應(yīng)用于中成藥的調(diào)配和其它領(lǐng)域[9-10]，藥用價(jià)值亟待開發(fā).

本文對4個(gè)不同產(chǎn)地的草果揮發(fā)油的成分進(jìn)行了對比分析，同時(shí)研究了不同產(chǎn)地草果揮發(fā)油的100%提取液對白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314、白色念珠菌臨床分離耐藥株23#、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌效果.

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1 儀器

電子天平CP114(奧豪斯儀器上海有限公司)；SG8200HPT型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)；SHZ-CBZ型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；低溫冷卻液循環(huán)泵DLSB-20L/30(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；101-4AS電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；FA2104分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；HP6890GC/5973MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent Technologies公司).

1.2 試劑

草果 產(chǎn)地1：怒江草果；產(chǎn)地2：保山草果；產(chǎn)地3：越南草果；產(chǎn)地4：綠春草果(經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室楊雅竹副教授鑒定為姜科豆蔻屬植物草果Amomum tsaoko的干燥成熟果實(shí))；正己烷(分析純，廣東光華科技股份有限公司，20181221)；氟康唑分散片(南昌弘益藥業(yè)有限公司，181001)；DMSO(BioFRoxx，EZ2921C395)；沙氏液體培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，1076161)；沙氏固體培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，1076641)；亞甲藍(lán)M-H瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，1081661)；LB固體培養(yǎng)基(Solarbio，20190529)；瓊脂(Agar，BioFRoxx，EZ1609C222)；氯化鈉(分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，20181203).

1.3 培養(yǎng)基和菌株

抗真菌活性檢測陽性對照藥物氟康唑溶于DMSO，離心后取上層清液，貯存濃度為 50 mg/mL，4 ℃ 密封避光保存.

1.3.1 培養(yǎng)基

1) 沙氏液體培養(yǎng)基 蛋白胨 10.0 g、葡萄糖 40.0 g 溶解于 1 000 mL 蒸餾水中， 115 ℃ 高壓滅菌30 min，備用.

2) 沙氏固體培養(yǎng)基 蛋白胨 10.0 g、葡萄糖 40.0 g、瓊脂 20 g 溶解于 1 000 mL 蒸餾水中，115 ℃ 高壓滅菌30 min，備用.

3) 亞甲藍(lán)M-H瓊脂培養(yǎng)基 M-H瓊脂+2%葡萄糖 +0.5 μg/mL 亞甲藍(lán)，121 ℃ 高壓滅菌 15 min，備用.

4) LB液體培養(yǎng)基 精密稱取胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、氯化鈉 10 g，置于 1 000 mL 藍(lán)蓋試劑瓶中，并用蒸餾水定容到 1 000 mL,121 ℃ 高壓滅菌 15 min，備用.

5) LB固體培養(yǎng)基 精密稱取胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、氯化鈉 10 g，瓊脂 15 g，置于 1 000 mL 藍(lán)蓋試劑瓶中，并用蒸餾水定容到 1 000 mL，121 ℃ 高壓滅菌 15 min，備用.

1.3.2 菌株

白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314、白色念珠菌臨床分離耐藥株23#(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院李玉葉惠贈)、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌.

2 方法與結(jié)果

2.1 草果揮發(fā)油得率

2.1.1 揮發(fā)油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取草果揮發(fā)油.稱取約 1.5 kg 草果藥材粗粉，投于 10 000 mL 圓底燒瓶中，加入6倍水量及沸石數(shù)顆，搖勻后置于電熱套中，連接揮發(fā)油提取器與球形冷凝管，參照2015版《中國藥典》四部通則2204揮發(fā)油測定法-甲法[12]，浸泡 8 h 后加熱至沸騰，并保持微沸 8 h，至揮發(fā)油提取器中不再有揮發(fā)油餾出，分離揮發(fā)油經(jīng)測量出油量后冷凍保存.

精密量取揮發(fā)油 0.5 mL，至 10 mL 量瓶，加正己烷，定容，混勻，過 0.45 μm 微孔濾膜，進(jìn)行GC- MS分析.

2.1.2 草果揮發(fā)油得率的計(jì)算

稱取約 1.5 kg 草果藥材粉末，用水蒸氣蒸餾法提取草果揮發(fā)油，按下述公式計(jì)算揮發(fā)油得率，結(jié)果見表1.

揮發(fā)油得率(mL/kg)=揮發(fā)油體積(mL)/草果粗粉重量(kg).

2.1.3 結(jié)果

根據(jù)揮發(fā)油量和草果重量計(jì)算出4個(gè)產(chǎn)地草果的揮發(fā)油得率.如表1所示，不同產(chǎn)地的草果，揮發(fā)油得率不同.4個(gè)地區(qū)草果按照不同揮發(fā)油得率從大到小依次為：怒江草果、保山草果、越南草果、綠春草果；其中揮發(fā)油得率最高的是怒江草果達(dá)到了 20.67 mL/kg，最低的是綠春草果為 13.73 mL/kg.

表1 各產(chǎn)地草果揮發(fā)油提取率表

2.2 草果揮發(fā)油成分分析

2.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件

GC條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 mm)；柱溫：起始溫度 40 ℃，程序升溫 3 ℃/min 至 80 ℃，再 5 ℃/min 升溫至 280 ℃，保持 5 min；柱流量為 1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度 250 ℃；柱前壓 100 kPa；進(jìn)樣量 1.0 mL；分流比 10∶1;載氣為高純氦氣.

MS條件：電離方式EI；電子能量70；傳輸線溫度 250 ℃；離子源溫度 230 ℃；四極桿溫度 150 ℃；質(zhì)量范圍35～500；采用wiley7n.l標(biāo)準(zhǔn)譜庫計(jì)算機(jī)檢索定性.

2.2.2 總離子流圖

采用 GC- MS 對草果揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行了分析.在測試條件下對4個(gè)不同產(chǎn)地的草果揮發(fā)油進(jìn)行 GC-MS 測試，測得上述4種揮發(fā)油的總離子流 (TIC) 如圖 1～4 所示.經(jīng)GC-MS 檢測，對不同產(chǎn)地草果揮發(fā)油的GC-MS分離出90個(gè)化合物.將各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)由 wiley7n.l標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索并結(jié)合有關(guān)參考文獻(xiàn)等，鑒定了其中73個(gè)化合物，用峰面積歸一化法計(jì)算各成分在揮發(fā)油的相對百分含量見表2.

圖1 怒江草果揮發(fā)油總離子流圖 圖2 保山草果揮發(fā)油總離子流圖

圖3 越南草果揮發(fā)油總離子流圖 圖4 綠春草果揮發(fā)油總離子流圖

2.2.3 成分分析

根據(jù)保留時(shí)間(t)，4個(gè)不同產(chǎn)地的草果揮發(fā)油共分離出化合物90個(gè)，其中4個(gè)產(chǎn)地的草果揮發(fā)油分離出共有成分化合物52個(gè)；將各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)由 wiley7n.l標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，鑒定出化合物成分73個(gè)，不同產(chǎn)地草果揮發(fā)油的GC-MS數(shù)據(jù)分析見表2.

表2 不同產(chǎn)地草果揮發(fā)油的GC-MS數(shù)據(jù)表

續(xù)表2

續(xù)表2

從表2 可知，4個(gè)不同產(chǎn)地草果揮發(fā)油鑒定出共有成分52個(gè)化合物，其中主要成分為烯烴類、醇類、醛類、酯類、其它(苯硼酸乙二醇酯、1,3-環(huán)己二烯、2-甲基-5-(1-甲基乙基)-單環(huán)氧化合物、1,2-二氫-5,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶碳腈等).

4個(gè)產(chǎn)地的草果揮發(fā)油中含量較高的共有已知組分經(jīng)統(tǒng)計(jì)為12個(gè)化合物，分別是：α-蒎烯、2-β-蒎烯、α-水芹烯、1,8-桉葉油素、2-辛烯醛、芳樟醇、4-松油醇、α-松油醇、Z-檸檬醛、1,2-二氫-5,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶碳腈、E-5-十二烯-1-醇醋酸酯、反-橙花叔醇；這12個(gè)共有成分占揮發(fā)油總含量的60%以上(分別占總揮發(fā)油的65.79%；64.99%；62.88%；67.28%).1,8-桉葉油素和α-水芹烯最主要成分，其中1,8-桉葉油素(含量分別為36.63%、38.17%、37.11%、39.12%)，差異不大.

表3 不同產(chǎn)地草果揮發(fā)油中含量較高的12個(gè)共有成分的GC-MS成分分析表

上述結(jié)果表明，草果揮發(fā)油的成分與生產(chǎn)地生態(tài)、品種有關(guān)，但主要的共有成分差異不大.

2.3 抑菌試驗(yàn)

2.3.1 抑菌試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法K-B法(標(biāo)準(zhǔn)濾紙片法)

取培養(yǎng)基上 37 ℃ 培養(yǎng)16～18 h 的純菌落，制備菌懸液，調(diào)整濃度為1×107 CFU/mL，每個(gè)平板各加載菌液 500 μL，立即用棉拭子均勻涂板，放置10 min左右，待菌液完全被平板吸收，用鑷子加載直徑為 6 mm 的無菌濾紙片.

加載紙片后，取一定量的100%揮發(fā)油加載在濾紙片的正中心，防止抑菌圈畸形，待樣品均勻、完全的吸收后，放入恒溫恒濕箱或CO2培養(yǎng)箱中，一般情況下，孵育18～24 h(真菌)或12～16 h(細(xì)菌)后，檢查每一塊平板，若接種平板滿意，抑菌圈應(yīng)為正圓形，菌落應(yīng)相互融合生長.測量抑菌環(huán)的直徑邊緣為80%被抑制即可，如果菌落生長較弱，應(yīng)該繼續(xù)培養(yǎng)20～24 h.

在不反光的黑色背景下讀取抑菌圈的直徑，抑菌圈的直徑包括紙片的直徑.抑菌圈的界限應(yīng)該是以肉眼觀察沒有明顯可見真菌生長的區(qū)域，在抑菌圈邊緣微弱生長的、僅能在放大鏡下觀察到的細(xì)小菌落應(yīng)忽略.

2.3.2 揮發(fā)油抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4個(gè)不同產(chǎn)地草果揮發(fā)油抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，草果揮發(fā)油對白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314抑菌圈的直徑都已經(jīng)超過整個(gè)培養(yǎng)皿(>40 mm)，整個(gè)培養(yǎng)皿不長菌，有很好的抑菌效果，抑菌效果明顯優(yōu)于氟康唑的抑菌效果.對白色念珠菌臨床耐藥株23#產(chǎn)地1與產(chǎn)地2揮發(fā)油的抑菌圈直徑都已經(jīng)超過整個(gè)培養(yǎng)皿(>40 mm)有很好的抑菌效果，產(chǎn)地3與4揮發(fā)油抑菌圈的直徑分別為20、22 mm，其抑菌效果也明顯優(yōu)于氟康唑.對金黃色葡萄球菌草果揮發(fā)油呈現(xiàn)出較好抑菌效果，抑菌圈的直徑對應(yīng)產(chǎn)地1、產(chǎn)地2、產(chǎn)地3、產(chǎn)地4分別為：18、7、14、13 mm.相對而言，草果揮發(fā)油對大腸桿菌抑菌效果沒有比較優(yōu)勢，但是仍顯現(xiàn)出抑菌效果.

表4 不同產(chǎn)地草果揮發(fā)油抑菌活性實(shí)驗(yàn)匯總表 mm

3 討論與結(jié)語

采用水蒸汽蒸餾法提取草果揮發(fā)油，4個(gè)產(chǎn)地的草果揮發(fā)油得率不同，其中怒江草果揮發(fā)油產(chǎn)率最高，為 20.67 mL/kg；上述4個(gè)產(chǎn)地均為低緯度高海拔地區(qū)，而怒江產(chǎn)草果揮發(fā)油產(chǎn)率最高可能與當(dāng)?shù)氐刭|(zhì)有關(guān).

4個(gè)產(chǎn)地的草果揮發(fā)油中共有12個(gè)相同的已知組分分別是：α-蒎烯，2-β-蒎烯，α-水芹烯，1,8-桉葉油素，2-辛烯醛，芳樟醇，4-松油醇，α-松油醇，Z-檸檬醛，1,2-二氫-5,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶碳腈，E-5-十二烯-1-醇醋酸酯，反-橙花叔醇.4個(gè)產(chǎn)地草果揮發(fā)油中含量最高的主要成分為1,8-桉葉油素占總揮發(fā)油的百分比分別為(36.63%；38.17%；37.11%；39.12%)，4個(gè)產(chǎn)地中草果揮發(fā)油12個(gè)共同組分占總揮發(fā)油的百分比分別為：產(chǎn)地1占65.79%；產(chǎn)地2占64.99%；產(chǎn)地3占62.88%；產(chǎn)地4占67.28%.產(chǎn)地不同，揮發(fā)油成分和比例均有差異，有待進(jìn)一步鑒定分析.

4個(gè)不同產(chǎn)地草果揮發(fā)油抑菌效果為白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314>白色念珠菌臨床耐藥株23#>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌，對白色念珠菌的抑菌效果具有顯著優(yōu)勢，這可能與揮發(fā)油的組份存在差異有關(guān).

本文以怒江、保山、越南、綠春等4地產(chǎn)草果的揮發(fā)油為研究對象，對其中的主要成分的含量進(jìn)行了對比，并圍繞常見的4種致病菌進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，為后期草果揮發(fā)油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了相關(guān)的數(shù)據(jù)支撐，彰顯了草果揮發(fā)油在抑菌方面價(jià)值，為草果的綜合開發(fā)提供理論依據(jù)同時(shí)為課題組后期重點(diǎn)研究怒江草果奠定了基礎(chǔ).