符佳穎 陳旭翔 許岱詩 劉欣 楊歡 周長青 吳海東 曾朝濤吳浩 鄭光輝 王彤*

近年來，骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）移植治療心肌梗死的優(yōu)越性得到了廣泛關(guān)注。MSCs 移植已被證實能夠有效縮小心肌梗死面積、形成新生血管、改善心室重塑、提高患者的心功能［1］。然而，多項臨床試驗指出MSCs 在移植后受到局部梗死微環(huán)境的影響導致生存能力低下，未能達到理想的治療效果［2］。因此，如何提高MSCs 在缺氧環(huán)境下的生存能力是干細胞移植亟需解決的關(guān)鍵問題。ELABELA（ELA）是一種內(nèi)源性肽類激素，課題組前期的實驗表明ELA 能夠通過改善和促進MSCs 的細胞增殖和遷移能力［3］。但ELA 是否能夠提高MSCs 抵抗氧化應激損傷的能力需要進一步驗證。本實驗通過采用過氧化氫（H2O2）誘導MSCs 凋亡，探討ELA 對MSCs 氧化應激損傷的影響及其最佳治療濃度。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級Sprague Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量（100±20）克，購于廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心，許可證號：SCXK（粵）2018-0034。實驗中對動物處理方法取得中山大學倫理委員會批準，批準號：2019-057-01。

1.2 方法 （1）細胞培養(yǎng)根據(jù)課題組已建立成熟的 方 法 進 行 分 離、培 養(yǎng) 及 鑒 定MSCs［4］。第3 代MSCs 用于后續(xù)實驗研究。（2）細胞分組及H2O2誘導細胞凋亡模型建立將體外培養(yǎng)的MSCs 隨機分為Control 組、H2O2組、500 nM ELA 組，1 μM ELA 組，5 μM ELA 組，10 μM ELA 組。H2O2組 細 胞 加 入 含400 μM H2O2的無血清培養(yǎng)基，在37℃條件下培養(yǎng)6 h，建立H2O2誘導細胞凋亡模型，模擬心肌梗死后體內(nèi)氧化應激微環(huán)境［5］。Control 組加入等量PBS；500 nM ELA 組，1 μM ELA 組，5 μM ELA 組，10 μM ELA 組各自加入不同濃度ELA（500 nM，1 μM，5 μM，10 μM）后進行H2O2誘導細胞凋亡。（3）MTS 法檢測細胞增殖及細胞活力將MSCs 按3×103 個/孔接種到96 孔板，每孔100 μl，待細胞貼壁。按（2）方法處理各組細胞后，每孔加入cellTiter96AQ 單溶液細胞增殖檢測試劑20 μl，于37℃孵育2 小時，應用酶標儀檢測A490 值。（4）DCFH-DA 熒光探針法檢測細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平收集各組MSCs 后，使其重懸于10 μM DCFH-DA中，充分混勻，置于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 分鐘。使用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3 次，以除去未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA 探針。應用熒光酶標儀（激發(fā)波長=485 nm，發(fā)射波長=520 nm）檢測各組細胞內(nèi)ROS 水平。細胞內(nèi)相對ROS 水平=各組熒光強度/Control 組熒光強度×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以（x ± s）表示。多組間差異比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 ELA 對MSCs 細胞增殖及細胞活力的影響通過MTS 實驗驗證ELA 是否能增強MSCs 在氧化應激損傷下的細胞增殖及存活能力。與Control 組相比，H2O2組的細胞增殖能力顯著降低（P＜0.05，圖1，2）。與H2O2組相比，500 nM ELA 組，1 μM ELA 組，5 μM ELA 組MSCs 保持良好的細胞活性（P＜0.05，圖1，2），且呈劑量依賴效應。盡管10 μM ELA 組細胞活力優(yōu)于H2O2組（P＜0.05，圖1，2），與5 μM ELA 組相比，其促進MSCs 細胞生存能力減低，提示5 μM ELA 促進氧化應激狀態(tài)下MSCs 細胞生存能力為最佳。

圖1 各組骨髓間充質(zhì)干細胞的OD490 值

圖2 各組骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞活力（%）

2.2 ELA 對MSCs 細胞內(nèi)ROS 水平的影響 通過檢測MSCs 細胞內(nèi)ROS 水平觀察ELA 是否能增強MSCs 抵抗氧化應激損傷。與Control 組相比，在氧化應激條件下，MSCs 的細胞內(nèi)ROS 水平含量上升（P＜0.05，圖3）。分別加入500 nM ELA，1 μM ELA，5 μM ELA 治療后，與H2O2組相比，MSCs 的細胞內(nèi)ROS 水平含量下降（P＜0.05，圖3），且與ELA 濃度梯度相關(guān)。MSCs 經(jīng)10 μM ELA 治療后，細 胞 內(nèi)ROS 水 平 高 于5 μM ELA 組，提 示5 μM ELA 是抑制MSCs 細胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的最佳濃度。

圖3 各組骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)ROS 水平

3 討 論

MSCs 是來源于骨髓并具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，盡管MSCs 治療心肌梗死取得了較大的研究進展，由于缺氧和氧化應激導致MSCs 在局部梗死心肌的存活率較低［6］，導致MSCs移植治療效率仍然不理想。ELA 分泌于胚胎干細胞，是由32 個氨基酸構(gòu)成的多肽。ELA 具有較強的胚胎信號活性，在早期心管向心血管譜系發(fā)育和分化中扮演著重要的角色［7］。研究證實，ELA 能夠有效調(diào)控心肌梗死模型大鼠的心肌重塑，增強心肌收縮力，改善心肌梗死后心功能［8］。然而，ELA 是否能夠改善MSCs 移植后在體內(nèi)氧化應激狀態(tài)下的生存能力目前未有相關(guān)研究。

本研究證實了ELA 能夠促進氧化應激狀態(tài)下MSCs 的存活能力，并探討了不同濃度ELA 對MSCs 細胞活力的保護作用。其中，500 nM ELA，1 μM ELA 及5 μM ELA 對MSCs 的保護作用呈現(xiàn)濃度依賴效應，并降低了細胞內(nèi)ROS 生成水平。研究表明，氧化應激狀態(tài)下ROS 水平升高，過度的氧自由基及其衍生物產(chǎn)生與細胞存活能力密切相關(guān)［9］。目前，已經(jīng)證實ELA 能夠通過PI3K/AKT 通路調(diào)控G1/S 階段細胞周期從而實現(xiàn)胚胎干細胞的自我更新和生存能力［10］?；谝陨涎芯堪l(fā)現(xiàn)，我們推測ELA 保護MSCs 抗氧化應激的作用可能與ROS 介導的PI3K/AKT 通路活化狀態(tài)有關(guān)。然而，10 μM ELA 對改善MSCs 在氧化應激狀態(tài)下的存活能力有所降低，其具體的原因需進一步驗證。

綜上所述，ELA 能夠增強氧化應激狀態(tài)下MSCs 的生存能力，有利于提高MSCs 在梗死心肌中的存活。本實驗的結(jié)果初步表明ELA 治療對于改善MSCs 抵抗氧化應激損傷是一種可行的方法，其作用機制有待進一步研究。