施建新 趙珩 閔仲生 譚城 李紅敏

摘要：目的 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法篩選荊芥-防風(fēng)配伍治療特應(yīng)性皮炎的作用靶點(diǎn)，探討治療特應(yīng)性皮炎作用機(jī)制。方法 利用TCMSP數(shù)據(jù)平臺(tái)，以口服利用度和類藥性分別篩選本配伍的有效活性成分同時(shí)預(yù)測作用靶點(diǎn);從Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索中藥靶點(diǎn)所對應(yīng)的人類基因，檢索Genecard和OMIM數(shù)據(jù)庫中特應(yīng)性皮炎相對應(yīng)的基因，再將疾病基因與中藥預(yù)測的靶點(diǎn)取交集，使用在線String工具對疾病基因與中藥的靶點(diǎn)交集進(jìn)行PPI互作分析。采用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病調(diào)控網(wǎng)，將藥物-疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。結(jié)果 IL6、AKT1、TNF等是荊芥-防風(fēng)配伍治療特應(yīng)性皮炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)，GO富集分析分析顯示荊芥-防風(fēng)配伍治療特應(yīng)性皮炎關(guān)鍵靶點(diǎn)設(shè)計(jì)生物過程條目多條，KEGG通路分析顯示IL17及TNF信號(hào)通路是荊芥-防風(fēng)配伍治療特應(yīng)性皮炎的主要機(jī)制通路。結(jié)論 荊芥-防風(fēng)藥對治療特應(yīng)性皮炎的機(jī)制可能與其干擾NF-κB在IL17及TNF信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄，影響炎癥因子IL-6等相關(guān)。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);荊芥-防風(fēng)配伍;特應(yīng)性皮炎;作用機(jī)制

中圖分類號(hào)：R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2021）03-0015-07

【Abstract】Objective： To explore the mechanism of Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility in the treatment of atopic dermatitis by using network pharmacology and bioinformatics methods to screen the targets. Methods： Based on the TCMSP data platform， the effective active ingredients of this compatibility were screened by oral availability and drug-like properties and the targets were predicted at the same time. The corresponding human gene was searched for the target of traditional Chinese medicine from the Uniprot database， and the specificity of the corresponding genes to dermatitis was searched in the Genecard and OMIM databases， and then the disease genes and the predicted targets were taken to intersect， and the intersection of the disease genes and the targets were used to perform PPI interaction analysis by the online String tool. Cytoscape software was used to construct a drug-component-target-disease regulation network， and the drug-disease key target protein was analyzed for GO function and KEGG pathway enrichment. Results： IL6， AKT1， TNF， etc. were the key targets of Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility in the treatment of atopic dermatitis. The GO enrichment analysis showed the key targets of Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility in the treatment of atopic dermatitis were designed with multiple biological process items. KEGG pathway analysis showed the IL17 and TNF signaling pathways were the main mechanism pathways for the treatment of atopic dermatitis with Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility. Conclusion： The mechanism of Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility drugs in the treatment of atopic dermatitis may be related to its interference with the transcription of NF-κB in the IL17 and TNF signaling pathways and the influence of the inflammatory factor IL-6.

【Key words】Network pharmacology;Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility;Atopic dermatitis;Mechanism of action

特應(yīng)性皮炎（atopicdermatitis，AD）是一種慢性瘙癢性且兒童發(fā)病率較高的皮膚病[1]。國外研究表明，在高收入國家中兒童AD發(fā)病率為15%～20%，成人AD發(fā)病率為1%～3%[2-3]。研究指出，AD發(fā)病的時(shí)間有可能會(huì)影響患者的臨床病程和持續(xù)時(shí)間，所以2歲之前發(fā)病的患者，他們的癥狀改善及病程控制通常好于發(fā)病較晚的患者，但此結(jié)論仍需要進(jìn)一步的調(diào)查證實(shí)[4]。

中醫(yī)古籍中并未出現(xiàn)“特應(yīng)性皮炎”的病名，的古籍中記載了一些與特應(yīng)性皮炎癥狀相似的疾病，如“奶癬、血風(fēng)瘡、四彎風(fēng)”等，古籍中記載的特征與特應(yīng)性皮炎極為相似。荊芥防風(fēng)具有解熱、陣痛、影響免疫功能、抗過敏等作用，然而荊芥、防風(fēng)復(fù)雜的化學(xué)成分及治療疾病的多樣化[5]，臨床通常難以明確荊芥防風(fēng)藥對治療特應(yīng)性皮炎具體作用機(jī)制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討其治療特應(yīng)性皮炎的可能作用機(jī)制，探索中醫(yī)藥治療AD的新方法。

1 資料與方法

1.1 荊芥、防風(fēng)化學(xué)成分虛擬篩選 在 TCMSP 平臺(tái)檢索荊芥、防風(fēng)主要活性成分的靶點(diǎn)蛋白，并在 Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫將預(yù)測出的靶點(diǎn)蛋白名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，選擇物種為“Homo sapiens”，轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的基因名稱，即得到藥物的潛在作用靶點(diǎn)。

1.2 疾病基因靶點(diǎn)預(yù)測 通過Genecard網(wǎng)站（https：//www.genecards.org/）和OMIM網(wǎng)站（https：//omim.org/）的檢索功能，搜索特應(yīng)性皮炎相對應(yīng)的基因，同時(shí)獲取特應(yīng)性皮炎基因數(shù)目。

1.3 網(wǎng)絡(luò)合并 使用在線工具String（https：//string-db.org）將AD基因與荊芥、防風(fēng)靶點(diǎn)取交集，獲取交集基因靶點(diǎn)很有可能是該藥對活性成分治療特應(yīng)性皮炎靶點(diǎn)。

1.4 PPI互作分析計(jì)算核心基因和繪制Cytoscape藥理網(wǎng)絡(luò)圖 將荊芥、防風(fēng)與特應(yīng)性皮炎取交集后的115個(gè)基因靶點(diǎn)進(jìn)行PPI互作分析，輸入Cytoscape3.7.2軟件中，構(gòu)建成分靶點(diǎn)基因PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行核心篩選，制成藥物干預(yù)疾病的相關(guān)基因關(guān)系圖。

1.5 基因富集分析 通過Bioconductor數(shù)據(jù)庫查詢藥物與疾病的共同靶點(diǎn)，利用R語言將基因symbol轉(zhuǎn)為基因ID，設(shè)置pvalue=0.05，qvalue=0.05對獲取的基因分別進(jìn)行GO富集和KEGG富集分析，進(jìn)一步說明中藥化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用。

2 結(jié)果

2.1 荊芥、防風(fēng)化學(xué)成分虛擬篩選 本實(shí)驗(yàn)通過閾值設(shè)定OB>30%，DL>0.18，共篩選出主要候選化合物種類29種，荊芥化合物種類11種，主要包括揮發(fā)油類、單萜類及黃酮類，防風(fēng)化合物種類18種，主要包括色原酮類、香豆精類、揮發(fā)油類、多炔類及多糖類，從候選化合物中共篩選出成分靶點(diǎn)550個(gè)，其中荊芥312個(gè)，防風(fēng)238個(gè)（表1）。

2.2 中藥和疾病基因靶點(diǎn)預(yù)測 荊芥-防風(fēng)通過Uniprot網(wǎng)站（https：//www.uniprot.org/）檢索中藥靶點(diǎn)對應(yīng)的人的基因，其中排除未找到及重復(fù)的基因，最終共獲取基因175個(gè)。再通過Genecard網(wǎng)站（www.genecards.org）檢索與AD對應(yīng)的致病基因，共獲取特應(yīng)性皮炎基因1430個(gè)。其中，荊芥-防風(fēng)所干預(yù)的特應(yīng)性皮炎疾病基因?yàn)?00個(gè)（圖1）。

2.3 網(wǎng)絡(luò)合并及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用String工具（string-db.org）構(gòu)建成分靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2）。通過計(jì)算每個(gè)基因的連接點(diǎn)數(shù)目，找出前30個(gè)PPI核心靶點(diǎn)，即IL6、AKT1、TNF等（圖3）。

2.4 繪制Cytoscape疾病-靶點(diǎn)藥理網(wǎng)絡(luò)圖 利用Cytoscape3.72軟件，制成藥物干預(yù)疾病的有效成分與相關(guān)基因關(guān)系圖（圖4）。

2.5 GO富集分析 利用R語言，獲取基因ID，通過GO富集分析獲取的100個(gè)基因，共獲得129條相關(guān)的富集條目，分子功能的作用主要表現(xiàn)在細(xì)胞因子結(jié)合受體細(xì)胞，因子活性等方面（圖5、圖6）。

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集結(jié)果分析結(jié)果（圖7）顯示，“荊芥-防風(fēng)”藥對治療特應(yīng)性皮炎的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)富集的通路共有164條，包括IL-17信號(hào)通路路徑（圖8）、TNF信號(hào)通路路徑（圖9）等。

3 討論

特應(yīng)性皮炎（AD）病因尚未明確，目前公認(rèn)其發(fā)病機(jī)制主要與皮膚屏障功能的異常、父母的遺傳、自身免疫功能異常及周圍環(huán)境因素相關(guān)。全球有超過20%的兒童及3%的成年人患有特應(yīng)性皮炎。2019年報(bào)道上海嘉定地區(qū)兒童的AD發(fā)病率約為2.54%[6]，與美國甚至歐洲等地相比，AD的在瑞典兒童中的患病率甚至能高達(dá)22.3%[7]。西醫(yī)多采用抗組胺類藥物，局部外用首選糖皮質(zhì)激素，雖能取得一定的療效，但各種不良反應(yīng)的發(fā)生也限制了它們的使用。尋找臨床療效確切，能有效降低復(fù)發(fā)率和毒副作用較小的方法及藥物，一直是各國臨床皮膚科醫(yī)生所關(guān)注的。

中醫(yī)雖無AD這一病名，但根據(jù)其發(fā)病原因及臨床表現(xiàn)，總結(jié)歸納后可歸屬于“濕瘡”、“浸淫瘡”、“四彎風(fēng)”等范疇，這其中尤以“四彎風(fēng)”與特應(yīng)性皮炎最為貼切[8]。風(fēng)邪襲入腠理是特應(yīng)性皮炎的病因之一，病機(jī)多為先天稟賦不耐，脾肺不足并外感風(fēng)濕熱邪，發(fā)于疾病所致，治則多以健脾利濕，清熱祛風(fēng)為主?！扒G芥防風(fēng)”藥對臨床運(yùn)用廣泛，它們作為君藥的眾多復(fù)方廣泛應(yīng)用于皮膚科[9-10]，除了具有良好的祛風(fēng)止癢的功效，常常用于蕁麻疹、慢性濕疹等疾病起的瘙癢及支氣管炎、過敏性鼻炎等各類過敏性疾病。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索“荊芥-防風(fēng)”藥對通過何種途徑對特應(yīng)性皮炎產(chǎn)生治療效果。通過PPI蛋白互作分析，共找到100個(gè)互作關(guān)系密切的基因，IL6、AKT1、TNF等，說明這些基因參與了“荊芥-防風(fēng)”藥對對特應(yīng)性皮炎的治療。通過GO功能富集分析及KEGG通路富集分析來闡釋作用靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路的作用，發(fā)現(xiàn)藥對在生物過程富集主要表現(xiàn)在對有機(jī)物的反應(yīng)，細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)，細(xì)胞對有機(jī)物的反應(yīng)，對含氧化合物的反應(yīng)，對化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)等方面。分子功能富集主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)結(jié)合，酶結(jié)合，信號(hào)受體結(jié)合，細(xì)胞因子受體結(jié)合等方面。細(xì)胞成分富集主要表現(xiàn)在細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)部分、細(xì)胞外區(qū)、膜筏、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器腔等部分，所以本藥對可以通過影響細(xì)胞因子及其受體，抑制IL6發(fā)揮治療作用[11-12]。通過KEGG分析及文獻(xiàn)回顧[13]，“荊芥防風(fēng)”藥對作用于AD的機(jī)制可能體現(xiàn)在其有效成分干預(yù)NF-KB在IL17和TNF這2條信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞因子的表達(dá)。在IL17通路中，藥對完全調(diào)節(jié)了下游炎癥因子IL1β、TNFα、IL6及IFNγ。TNF通路中也大量影響了炎癥因子、轉(zhuǎn)錄因子等，從而達(dá)到治療的特應(yīng)性皮炎結(jié)果。

IL-17及TNF這2條信號(hào)通路可能是本藥對治療特應(yīng)性皮炎的潛在通路[14-15]。既往研究已經(jīng)表明IL17在多種自身免疫疾病及炎癥致病因子中發(fā)揮了重要作用[16]，最近研究也表明，IL17會(huì)在患兒中有明顯的升高[17]。另外新生兒來源的IL-17可以預(yù)防特應(yīng)性皮炎的發(fā)生，因?yàn)镮L17對于皮膚的穩(wěn)定和皮膚炎癥具有雙向調(diào)節(jié)的作用[18]。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測術(shù)提示：雖然IL17在AD和銀屑病的皮損中都有表達(dá)，CD4+來源的IL17在兩種疾病中的表達(dá)的沒有顯著差異，但CD8+來源的IL17在銀屑病中表達(dá)比在AD中的表達(dá)具有明顯的意義[19]。目前已經(jīng)針對IL17這個(gè)通路，開發(fā)了治療銀屑病的生物制劑[20]。IL17的升高會(huì)導(dǎo)致AD的發(fā)生，所以針對IL17的治療很可能是治療AD的一個(gè)新的通路[21]。

在TNF通路中，本藥對通過影響NF-KB轉(zhuǎn)錄，來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子JUN、Fos及炎癥因子IL-6、IL1b等達(dá)到治療特應(yīng)性皮炎的結(jié)果。TLR4[22]的缺少會(huì)促進(jìn)TNF-α的表達(dá)，而TNF-α可以單獨(dú)或者聯(lián)合Th2細(xì)胞因子降低神經(jīng)酰胺的含量，從而影響皮膚屏障功能[23]。研究表明，急性AD皮損中的角質(zhì)形成細(xì)胞中Th2細(xì)胞因子和腫瘤壞死因子-α可增強(qiáng)GITRL（Glucocorticoid-inducedTNFreceptor-relatedproteinligand）的表達(dá)。這一觀察表明細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的角質(zhì)形成細(xì)胞GITRL表達(dá)與其在AD炎癥反應(yīng)中的作用有關(guān)[24]。

綜上所述，通過對“荊芥-防風(fēng)”相關(guān)靶點(diǎn)與化學(xué)成分的作用進(jìn)行分析，通過圖形的可視化發(fā)現(xiàn)藥對在分子水平上的復(fù)雜的作用原理，展示網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究“藥物-疾病-基因-靶點(diǎn)”的相互關(guān)系及其影響，換個(gè)新穎的角度展示中藥治療疾病原理，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法尋找“荊芥-防風(fēng)”藥對治療特應(yīng)性皮炎的可能的作用機(jī)制，為日后動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供可能的治療通路提供依據(jù)。但考慮到數(shù)據(jù)庫不夠完整，人體內(nèi)其他藥代動(dòng)力學(xué)的影響分析不夠徹底，還需要更深入的研究來探索其具體機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1]Silverberg Jonathan I，Hanifin Jon M，Adult eczema prevalence and associations with asthma and other health and demographic factors： a US population-based study[J].J Allergy Clin Immunol，2013，132（5）：1132-1138.[ZK）]

[2]Nutten Sophie，Atopic dermatitis：global epidemiology and risk factors[J].Ann Nutr Metab，2015，66（1）：8-16.

[3]Kabashima Kenji，New concept of the pathogenesis of atopic dermatitis： interplay among the barrier， allergy， and pruritus as a trinity[J].J Dermatol Sci， 2013，70（1）：3-11.

[4]Wananukul Siriwan，Chatproedprai Susheera，Tempark Therdpong，et al. The natural course of childhood atopic dermatitis： a retrospective cohort study[J].Asian Pac J Allergy Immunol，2015，33（2）：161-168.

[5]于柳，王哲，武志強(qiáng)，等.藥對荊芥-防風(fēng)的現(xiàn)代研究現(xiàn)狀[J].中藥藥理與臨床，2013，29（05）：150-155.

[6]羅瑞靜，劉杰，彭勇，等.上海市嘉定區(qū)兒童特應(yīng)性皮炎中醫(yī)證候分布規(guī)律的臨床流行病學(xué)調(diào)查[J].中國皮膚性病學(xué)雜志.2019.33（8）：943-948.

[7]Sybilski Adam J，Raciborski Filip，Lipiec Agnieszka，et al. Epidemiology of atopic dermatitis in Poland according to the Epidemiology of Allergic Disorders in Poland （ECAP） study[J].J Dermatol，2015，42（2）：140-147.

[8]康潤芳，金浩然，楊恩品.特應(yīng)性皮炎的中西醫(yī)治療進(jìn)展[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2015，36（4）：82-83.

[9]黃曉嬋，朱明芳.朱明芳教授運(yùn)用消風(fēng)散治療皮膚病驗(yàn)案舉隅[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2020，41（5）：1-3.

[10]謝筱多，李忻紅.《醫(yī)宗金鑒》中經(jīng)方在治療濕疹中的應(yīng)用[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2011，32（11）：49-50.

[11]Yasui Masahiro，Matsushima Miyoko，Omura Aya，et al. The Suppressive Effect of Quercetin on Toll-Like Receptor 7-Mediated Activation in Alveolar Macrophages[J].Pharmacology，2015，96（5-6）：201-209.

[12]Li Ruipeng，Zhao Di，Qu Rong，et al. The effects of apigenin on lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice[J].Neurosci Lett，2015（594）：17-22.

[13]Lee Yonghyeon，Choi Hyeon Kyeong，Ndeh Kaudjhis Patrick Ulrich，et al. Inhibitory Effect of Centella asiatica Extract on DNCB-Induced Atopic Dermatitis in HaCaT Cells and BALB/c Mice[J].Nutrients，2020，12（2）：90.

[14]Ma Lei，Xue Hai-Bo，Guan Xiu-Hao，et al. Possible role of Th17 cells and IL-17 in the pathogenesis of atopic dermatitis in northern China[J].J Dermatol Sci，2012，68（1）：66-68.

[15]Lee Kyu-Shik，Chun So-Young，Lee Min-Gu，et al. The prevention of TNF-α/IFN-γ mixture-induced inflammation in human keratinocyte and atopic dermatitis-like skin lesions in Nc/Nga mice by mineral-balanced deep sea water[J].Biomed Pharmacother，2018（97）：1331-1340.

[16]Sgnotto Fábio D R，de Oliveira Marilia G，Lira Aline A L，et al. IgG from atopic dermatitis patients induces IL-17 and IL-10 production in infant intrathymic TCD4 and TCD8 cells[J].Int J Dermatol，2018，57（4）：434-440.

[17]Santos Ludimila S，Sgnotto Fabio da Ressurei？？o，Sousa Thamires R，et al. IgG from atopic dermatitis patients induces non-atopic infant thymic invariant natural killer T （iNKT） cells to produce IL-4， IL-17， and IL-10[J].Int J Dermatol，2020，59（3）：359-364.

[18]Spidale Nicholas A，Malhotra Nidhi，F(xiàn)rascoli Michela，et al. Neonatal-derived IL-17 producing dermal γδ T cells are required to prevent spontaneous atopic dermatitis[J].Elife，2020（9）：50.

[19]Hijnen Dirkjan，Knol Edward F，Gent Yoony Y，et al. CD8（+） T cells in the lesional skin of atopic dermatitis and psoriasis patients are an important source of IFN-γ， IL-13， IL-17， and IL-22[J].J Invest Dermatol，2013，133（4）：973-979.

[20]Loft N D，Vaengebjerg S，Halling A-S，et al. Adverse events with IL-17 and IL-23 inhibitors for psoriasis and psoriatic arthritis： a systematic review and meta-analysis of phase III studies[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2020（34）：1151-1160.

[21]Chaudhary Sujeet K，Singh Shanker K，Kumari Priyambada，et al. Alterations in circulating concentrations of IL-17， IL-31 and total IgE in dogs with atopic dermatitis[J].Vet Dermatol，2019，30（5）：383-383.

[22]Lesiak A，Smolewski P，Sobolewska-Sztychny D，et al. The role of T-regulatory cells and Toll-like receptors 2 and 4 in atopic dermatitis[J].Scand J Immunol，2012，76（4）：405-410.

[23]Danso Mogbekeloluwa O，van Drongelen Vincent，Mulder Aat，et al. TNF-α and Th2 cytokines induce atopic dermatitis-like features on epidermal differentiation proteins and stratum corneum lipids in human skin equivalents[J].J Invest Dermatol，2014，134（7）：1941-1950.

[24]Byrne A M，Goleva E，Chouiali F，et al. Induction of GITRL expression in human keratinocytes by Th2 cytokines and TNF-α： implications for atopic dermatitis[J].Clin Exp Allergy，2012，42（4）：550-559.

（收稿日期：2020-11-02）