戴小麗 許燕燕 劉濤 侯彥強(qiáng)

1上海市松江區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 201600；2上海市松江區(qū)中心醫(yī)院病理科 201600通信作者：許燕燕，Email：274371867@qq.com

肺結(jié)核病目前仍然是嚴(yán)重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題，尤其新發(fā)肺結(jié)核患者的診斷和治療方案很大程度上依賴于結(jié)核分支桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢查。疑似新發(fā)肺結(jié)核病患者初次痰菌抗酸涂片檢測、培養(yǎng)以及鑒定對結(jié)核病的診治有重要的臨床價(jià)值。傳統(tǒng)的痰涂片抗酸染色陽性率較低，L-J 固體培養(yǎng)法耗時(shí)較長，液體分枝桿菌培養(yǎng)法不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌。三者均不是較為理想的結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測方法。為了滿足臨床需求，尋找一種適用于基層單位的簡單快速的結(jié)核分枝桿菌檢測鑒定方法顯得十分迫切。

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物濾液蛋白64（MPB64）是對人致病的人結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和非洲結(jié)核分枝桿菌等結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群在菌群培養(yǎng)過程中分泌到菌體外的分子量為24 kDa 的特異性蛋白質(zhì)，它是在牛結(jié)核分枝桿菌弱毒株BCG 中的培養(yǎng)液中首次分離的，而在非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（NTM）中不形成MPB64［1］。本次研究利用結(jié)核分枝桿菌免疫膠體金法對該菌分泌的MPB64 蛋白進(jìn)行檢測，探討MPB64免疫膠體金檢測法在肺結(jié)核早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標(biāo)本來源 收集2018年9月至2019年8月本院肺結(jié)核門診和住院的經(jīng)MGIT 960 液體分枝桿菌培養(yǎng)儀培養(yǎng)陽性的疑似新發(fā)肺結(jié)核患者210 例（所有收集標(biāo)本均經(jīng)過患者知情同意），所有培陽標(biāo)本均經(jīng)抗酸染色確認(rèn)為抗酸性菌。其中，男147例，女63例，年齡最大83歲，最小16歲，平均年齡38.45歲。本地人口65例，流動(dòng)人口145例。肺結(jié)核病根據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的WS288.2017《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》［2］中臨床癥狀、體征以及胸部影像學(xué)檢查等確診。

1.1.2 試劑和儀器 抗酸染液購自珠海BASO 生物技術(shù)有限公司，結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒（膠體金法）由杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn)，液體分枝桿菌培養(yǎng)基、培養(yǎng)添加劑以及消化液均為美國BD 公司生產(chǎn)，固體中性羅氏培養(yǎng)基為上海疾控生物科技有限公司生產(chǎn)，以上試劑均由上海市疾病預(yù)防控制中心提供。液體分枝桿菌快速全自動(dòng)培養(yǎng)儀為BD BACTEC MGIT 960，離心機(jī)型號(hào)為Heal Force Neofuge 1600。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本留取 患者留取即時(shí)痰、夜間痰和次日晨痰共3 次，涂片染色操作和質(zhì)控方法參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［3］進(jìn)行。

1.2.2 標(biāo)本培養(yǎng) 無菌取痰標(biāo)本2.0 ml，加入事先準(zhǔn) 備 好 的1～2 倍 體 積 的2% NALC-NaOH（N- 乙酰-L-半胱氨酸-NaOH）標(biāo)本前處理液，強(qiáng)力旋渦振蕩20 s 后室溫靜置15～20 min。然后加入pH 值6.8 磷酸鹽緩沖液（PBS）至50.0 ml，3 000 g 離心15 min 后，再棄上清液，沉淀中加入1.0 ml pH 6.8的PBS制備成懸濁液。處理后取0.5 ml 標(biāo)本接種至MGIT 960 培養(yǎng)管進(jìn)行液體培養(yǎng)，接種完成后培養(yǎng)管上機(jī)檢測。標(biāo)本接種前，在MGIT 7.0 ml 培養(yǎng)管中事先加入0.8 ml 以Growth Supplement（生長添加劑）溶解后的PANTA（雜菌抑制劑）。

1.2.3 膠體金法檢測 將液體培陽的標(biāo)本全部進(jìn)行涂片抗酸染色鏡檢，取確定為抗酸桿菌的標(biāo)本0.1 ml 滴加入MPB64 免疫膠體金法檢測板的加樣區(qū)，15 min 后觀察檢測板的判定部，只有當(dāng)檢測線和質(zhì)控線雙方都確認(rèn)出現(xiàn)紫紅色條帶方判定結(jié)果為陽性。在控制區(qū)出現(xiàn)紫紅色條帶，而在檢測區(qū)未出現(xiàn)則為陰性結(jié)果。如果控制區(qū)未出現(xiàn)任何條帶則需重新檢測。

1.2.4 菌種鑒定 取液體培陽并經(jīng)抗酸染色鏡檢確認(rèn)為抗酸桿菌的培養(yǎng)液0.1 ml 接種到固體中性羅氏培養(yǎng)基中，210 例標(biāo)本在固體培養(yǎng)基上均生長良好，待菌落生長占固體培養(yǎng)基斜面面積1/2以上時(shí)，將其送至上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治科進(jìn)行PNB 法、TCH 法和28℃培養(yǎng)試驗(yàn)，并以其鑒定結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 質(zhì)量控制 抗酸染色質(zhì)控涂片由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供，室內(nèi)質(zhì)評為每周進(jìn)行平行檢測抗酸染色陰陽性質(zhì)控片，結(jié)果均合格。室間質(zhì)評（EQA）為定期隨機(jī)涂片抽樣送至上海市疾病預(yù)防控制中心參加盲法復(fù)檢評估，各指標(biāo)均合格。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上海市疾病預(yù)防控制中心菌群鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算MPB64 膠體金法敏感性和特異性。敏感性（%）=MPB64 膠體金法檢測出的MTC 感染例數(shù)/上海市疾病預(yù)防控制中心菌群鑒定的MTC感染例數(shù)×100%；特異度（%）=MPB64 膠體金法檢測出的非MTC 感染例數(shù)/上海市疾病預(yù)防控制中心菌群鑒定的非MTC感染例數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

210例液體培陽的標(biāo)本經(jīng)膠體金法檢測后，檢測結(jié)果與原患者痰直接涂片抗酸染色法結(jié)果對比見表1。涂片法的陽性率為48.57%（102/210），膠體金法的陽性率為90.00%（189/210），膠體金法與涂片法的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，膠體金法的敏感性明顯高于涂片法。

表1 膠體金法與痰涂片法比較（n=210）

將210 例液體培陽標(biāo)本送至上海市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果見表2。由表2 可見，經(jīng)鑒定確診為MTC 感染者有187 例，占比89.05%（187/210），非MTC 感染者23 例，占比10.95%（23/210）。膠體金法在初篩結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的敏感性為97.86%（183/187），特異性為73.91%（17/23），準(zhǔn)確度為95.24%（200/210），陽性預(yù)測值為96.83%（183/189），陰性預(yù)測值為80.95%（17/21）。

表2 膠體金法與金標(biāo)準(zhǔn)比較（例）

3 討 論

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群引起的疾病，而非肺結(jié)核分枝桿菌病由于其臨床表現(xiàn)與肺結(jié)核擁有相似的全身中毒癥狀和局部損害，經(jīng)常被誤診為結(jié)核病而耽誤疾病的診療［4］。肺結(jié)核的早發(fā)現(xiàn)、早確診成為了當(dāng)下結(jié)核病研究的熱點(diǎn)之一。MPB64是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群分泌到菌體外的特異性蛋白質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，在新發(fā)培陽的患者中，MPB64 膠 體 金 法 的 陽 性 率 為90.00%，高 于 張 濤 等［5］的83.25%（169/203），明顯高于痰涂片直接抗酸染色法的48.57%。膠體金法陽性率之所以較高，考慮原因如下：作為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群分泌的特異性蛋白，MPB64 不論是在液體還是固體培養(yǎng)基中，或是在患者的痰液以及肺排泄物中都有存在的可能，且能指示分枝桿菌的早期生長［6］。本研究中，患者的標(biāo)本已經(jīng)經(jīng)過了MGIT 960 液體分枝桿菌培養(yǎng)儀一定時(shí)間的培養(yǎng)，更是增加了MPB64 在液體培養(yǎng)物中的分泌量，從而提高了檢出率。痰直接涂片抗酸染色鏡檢陽性率之所以較低考慮原因如下：陽性率和患者標(biāo)本的留取質(zhì)量有關(guān)，來自肺深部的干酪樣痰、血痰、黏液痰等合格標(biāo)本的檢出率較高；每毫升痰標(biāo)本中需要至少5 000～10 000 個(gè)抗酸桿菌才能檢出；抗酸桿菌在患者體內(nèi)不是連續(xù)性排出而是間隔性排出，也成為痰涂片法檢出率不高的原因之一。

雖然膠體金法相較于痰涂片抗酸染色法在診斷肺結(jié)核方面陽性率高，但目前關(guān)于MPB64 的研究主要集中于其對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種的鑒定。將液體培陽患者的標(biāo)本進(jìn)行膠體金法檢測和上海市疾病預(yù)防控制中心菌種鑒定結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，MPB64 膠體金法在鑒別MTC 方面的敏感度為97.86%（183/187），和張濤等［5］將MGIT 960 液體培養(yǎng)得到的203 例分枝桿菌陽性菌株進(jìn)行MPB64 抗原檢測，免疫膠體金法97.70%（169/173）的敏感度相似，高于周剛等［7］在162例結(jié)核分枝桿菌陽性的臨床標(biāo)本的檢測中，MPB64抗原檢出率為95.70%的敏感度。但是，本研究中膠體金法的特異度為73.91%（17/23），相較于而張濤等［5］研究中100.00%的特異度偏低。本研究中4例MTC經(jīng)MPB64膠體金法檢測為陰性的可能原因如下：結(jié)核菌中mycobacterium bovis BCG的幾個(gè)亞株（copenhagen 株、glaxo株、pasteur株、tice株）不產(chǎn)生MPB64［7］，所以判定為陰性；結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物濾液蛋白64編碼基因發(fā)生突變［5］，產(chǎn)生TGA 終止碼，部分C末端區(qū)域缺失［8］，故而無法檢測到MPB64；液體培養(yǎng)基出現(xiàn)陽性信號(hào)時(shí)，分支桿菌分泌的MPB64蛋白釋放量不足［9］，尚未達(dá)到膠體金法的檢出線。6 例診斷為非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的菌株中膠體金法鑒定為陽性，可能是膠體金法為假陽性，也可能標(biāo)本中存在微量結(jié)核分支桿菌，具體什么原因?qū)е玛栃杂写M(jìn)一步探討?？傮w看來，MPB64 免疫膠體金法鑒定MTC時(shí)的準(zhǔn)確度為95.24%（200/210）。

綜上所述，在新發(fā)肺結(jié)核患者的診斷中，MPB64免疫膠體金法有較高的敏感性、特異性和準(zhǔn)確度，膠體金法不僅僅可以明顯提高抗酸桿菌的檢出率，而且能夠較為快速地鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，可彌補(bǔ)BACTEC MGIT 960 液體培養(yǎng)系統(tǒng)尚不能進(jìn)行菌種鑒定的不足。MPB64免疫膠體金法已有成品試劑盒，15 min 可出檢測報(bào)告，具有操作方便、快速、無須特殊儀器投入等多種優(yōu)點(diǎn)，在結(jié)核分枝桿菌的快速檢測方面擁有較好的應(yīng)用前景，適合于各基層試驗(yàn)應(yīng)用于肺結(jié)核病的早期臨床診斷。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。