夏明珠， 王 琦， 黃 志， 樂 琴， 姜遠旭△

[1深圳市羅湖醫(yī)院集團羅湖區(qū)人民醫(yī)院，2深圳市人民醫(yī)院（南方科技大學第一附屬醫(yī)院，暨南大學第二臨床醫(yī)學院）麻醉科，3深圳市麻醉醫(yī)學工程技術中心，廣東深圳518020]

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是急性呼吸窘 迫 綜 合 征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的早期形式，肺水腫是ALI 最重要的特征[1]。肺水腫導致的頑固性低氧血癥，常危及患者生命。盡管過去對ALI 的治療作了多種探索，但只有小潮氣量肺保護性通氣及俯臥位通氣收到了比較明確的效果[2]，藥物治療尚未取得突破。因ALI發(fā)病機制復雜，雖然在某些方面取得了進展，但ALI 臨床死亡率仍然高達30%～40%[2]，給家庭社會帶來了沉重負擔。因此，尋求有效減輕肺水腫的治療藥物尤為重要。

右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一種高選擇 性α2腎 上腺素 能受體（α2adrenergic receptors，α2AR）激動劑，具有良好的鎮(zhèn)靜作用[3]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，Dex 可抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎癥細胞因子而發(fā)揮抗炎作用[4-6]，且能減輕不同致病因素所致的ALI 肺水腫[7-8]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)Dex 減輕肺水腫的作用與上調(diào)水通道蛋白（aquaporin，AQP）有關[9]。研究表明，肺泡內(nèi)水的清除不但與AQP 有關、更與肺泡上皮細胞鈉離子轉(zhuǎn)運有關[10]，其中鈉鉀ATP 酶（Na+/K+-ATPase）在鈉離子轉(zhuǎn)運及肺泡液體轉(zhuǎn)運中扮演重要角色[11-12]。那么，Dex 減輕肺水腫的作用是否與Na+/K+-ATPase 的表達有關，其機制又如何，尚不清楚。因此，本研究致力于觀察Dex 是否通過上調(diào)Na+/K+-ATPase 表達而減輕脂多糖誘導的ALI 相關肺水腫，同時進一步探究其機制。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級Wistar 大鼠24 只，4～6 周齡，體重180～220 g，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2019-0035。所有大鼠均在恒溫（25℃），恒濕（50%）條件下飼養(yǎng)，實驗前均經(jīng)歷至少1個晝夜循環(huán)，且禁食12 h，自由飲水。

1.2 藥物和試劑 細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS；Escherichia coli055：B5）購自Sigma；右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥公司）；測定TNF-α、IL-β、IL-6 和IL-10 的ELISA 試劑盒以及測定丙二醛（malonaldehyde，MDA）的和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；抗α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase 和細胞外信號調(diào)節(jié)激 酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）抗體（Abcam）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG Ⅱ抗（CST）；抗β-actin抗體（Santa Cruz）。

2 方法

2.1 模型建立和分組 24 只大鼠隨機分為生理鹽水（normal saline，NS）對照組、急性肺損傷模型組（LPS 組）、右美托咪定治療組（LPS+Dex 組）和α2AR抑制劑育亨賓（yohimbine，YHB）和右美托咪定合用治療組（LPS+Dex+YHB 組）。LPS組大鼠經(jīng)腹腔注射LPS（20 mg/kg）誘導ALI模型；LPS+Dex組大鼠于LPS注射后即刻腹腔注射Dex 100 μg/kg 進行干預；LPS+Dex+YHB 組大鼠腹腔注射0.1 mg/kg YHB，30 min后注射LPS 和Dex；以腹腔注射NS 作為對照。干預完成后8 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg 麻醉大鼠，頸動脈放血處死動物。

2.2 肺組織病理學檢查 取部分肺組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋及切片，HE 染色。采用半定量評分系統(tǒng)評價肺損傷，包括肺泡充血、肺泡出血、中性粒細胞浸潤和肺泡壁厚度。評分標準如下：0分為無損傷，1 分為輕度損傷（25%），2 分為中度損傷（50%），3 分為重度損傷（75%），4 分為極重度損傷（100%）。各項評定分數(shù)相加為肺損傷總評分。

2.3 動脈血氧分壓（PaO2）及氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）的檢測 大鼠處死前，用肝素注射器經(jīng)頸動脈抽取動脈血0.5 mL 進行血氣分析，測PaO2，依據(jù)吸入氧濃度計算PaO2/FiO2。

2.4 肺指數(shù)及肺組織濕/干重比（W/D）的測定 大鼠處死后，立即剖胸，取出全肺，稱重。以全肺濕重除以體重得出的數(shù)值為肺指數(shù)。取出右肺上葉，精確稱重后（濕重），置75 ℃恒溫烤箱中，烘烤24 h 至恒重后稱重（干重），計算W/D 值。

2.5 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的獲取及其中TNF-α、IL-β、IL-6 和IL-10 濃度的檢測 大鼠處死后，立即剖胸，暴露心肺，分離左右主支氣管，結(jié)扎右支氣管。自制導管插入主支氣管。然后，將2 mL 冷磷酸鹽緩沖生理鹽水注入左肺，并來回抽取3 次。收取支氣管肺泡灌洗液，采用ELISA 法測定TNF-α、IL-β、IL-6 和IL-10 濃度，嚴格按照說明書操作。

2.6 肺組織中MDA 濃度及MPO 活性的檢測 取肺組織100 mg解凍，制備肺組織勻漿用于測定MDA 濃度和MPO活性，嚴格按說明書操作。

2.7 Western blot 檢測肺組織α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase 和p-ERK1/2 的蛋白水平 分別取適量的肺組織，加入蛋白裂解液冰上勻漿，離心收取上清液，提取總蛋白并定量。應用10% SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。脫脂奶粉溶液封閉1.5 h；洗 膜 后 加 入 抗α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase、p-ERK1/2 和β-actin 抗體，4℃孵育過夜；洗膜后加入Ⅱ抗，室溫下孵育2 h，洗膜后加入化學發(fā)光增強劑，自顯影。采用圖像分析處理系統(tǒng)對蛋白條帶掃描分析，測得的目的蛋白吸光度值與β-actin吸光度值的比值表示各蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件行單因素方差分析（one-way AONVA）和SNK-q檢驗，ALI 評分采用Kruskal-Wallis檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 肺組織病理學檢查

肺組織HE 染色顯示，NS 對照組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常；LPS 組肺組織間隔增厚，肺血管充血，有大量炎癥細胞浸潤；Dex 治療組肺組織病理變化減輕，見圖1A。肺損傷分數(shù)比較顯示，與NS 組相比，LPS組肺損傷分數(shù)升高（P＜0.01）；Dex 治療組肺損傷分數(shù)低于LPS 組（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex 的作用，肺損傷分數(shù)升高（P＜0.01），見圖1B。

2 各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2的變化

與NS對照組相比，LPS組PaO2及PaO2/FiO2降低（P＜0.01）；Dex 治療組PaO2及PaO2/FiO2高于LPS 組（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex 的作用（P＜0.05），見圖2。

3 各組大鼠肺指數(shù)和W/D的變化

與NS 對照組相比，LPS 組肺指數(shù)和W/D 增加（P＜0.01）；Dex 治療組肺指數(shù)和W/D 低于LPS 組（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex 的作用（P＜0.01），見圖3。

4 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-β、IL-6和IL-10濃度的變化

與NS 對照組相比，LPS 組TNF-α、IL-β 和IL-6 及IL-10 濃度升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，Dex 治療組TNF-α、IL-β 和IL-6 濃度降低，IL-10 濃度進一步升高（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex 的作用（P＜0.01），見圖4。

5 肺組織MDA濃度及MPO活性的變化

與NS 對照組相比，LPS 組MDA 的濃度及MPO的活性升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，Dex 治療組MDA 的濃度及MPO 的活性降低（P＜0.01），而α2AR抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex 的作用（P＜0.05），見圖5。

6 各組大鼠α1 Na+/K+-ATPase和β1 Na+/K+-ATPase蛋白水平的變化

與NS 對照組相比，LPS 組α1Na+/K+-ATPase 和β1Na+/K+-ATPase 的蛋白水平降低（P＜0.01）；與LPS 組比較，Dex 治療組的α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase 蛋白水平升高（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex的作用（P＜0.01）），見圖6。

7 各組大鼠p-ERK1/2蛋白水平的變化

與NS 對照組相比，LPS 組p-ERK1/2 的蛋白水平降低（P＜0.01）；與LPS組比較，Dex治療組p-ERK1/2的蛋白水平升高（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex的作用（P＜0.01），見圖7。

討論

LPS是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要成分，常用來誘導ALI 模型[13]。我們的研究結(jié)果清楚地表明，LPS 導致ALI 大鼠肺指數(shù)和W/D 比值明顯升高，而Dex 降低了肺指數(shù)和W/D 比值，說明Dex 減輕了LPS誘導的ALI 大鼠肺水腫。此外，肺組織病理學的檢查發(fā)現(xiàn)，在ALI 模型組，肺泡間隔增厚，肺泡充血，炎癥細胞浸潤，而Dex治療則明顯改善了LPS導致的肺組織病理學改變。與這些研究結(jié)果一致，LPS 導致PaO2和PaO2/FiO2顯著降低，給予Dex 治療后，PaO2和PaO2/FiO2上升，表明肺水腫的消除可有效改善氧合功能，從而有利于ALI患者的轉(zhuǎn)歸。

Figure 1. Pathological changes and injury scores of lung tissues（HE staining，×200）. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group圖1 HE染色觀察右美托咪定對各組大鼠肺組織病理學改變及肺損傷分數(shù)的影響

Figure 2. Effects of Dex on PaO2 and PaO2/FiO2 in rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&P＜0.05 vs LPS+Dex group.圖2 右美托咪定對各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2的影響

肺水腫的消除不僅依賴于肺泡內(nèi)液生成的減少，更依賴于肺泡內(nèi)液體的清除。研究發(fā)現(xiàn)，Na+/K+-ATPase在肺泡上皮細胞膜上表達增加或其活性增強能夠促進肺泡液體清除[14]。相反，Na+/K+-ATPase 在肺泡上皮細胞膜上低表達或活性被抑制則導致肺泡內(nèi)液體清除降低[15-17]。近年來的研究表明：不同致病因素導致的ALI 肺組織Na+/K+-ATPase 表達降低，肺泡內(nèi)液體清除也降低[18-20]，提示維持肺泡上皮細胞Na+/K+-ATPase 正常表達，有利于促進肺泡內(nèi)液體清除及減輕肺水腫。在本研究中，我們觀察到LPS 可導致肺組織α1Na+/K+-ATPase 和β1Na+/K+-ATPase 的表達降低，Dex 治療明顯上調(diào)α1Na+/K+-ATPase 和β1Na+/K+-ATPase 的表達。這些結(jié)果提示，Dex 減輕肺水腫的作用與促進Na+/K+-ATPase的表達有關。

Figure 3. Effects of Dex on W/D ratio（A）and lung index（B）in the rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖3 右美托咪定對各組大鼠W/D和肺指數(shù)的影響

Figure 4. Effects of Dex on TNF-α（A），IL-β（B），IL-6（C）and IL-10（D）in BALF in rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖4 右美托咪定對各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-β、IL-6和IL-10濃度的影響

Figure 5. Effects of Dex on MPO activity（A）and MDA level（B）in the rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖5 右美托咪定對各組大鼠肺組織MPO活性和MDA水平的影響

Figure 6. Effects of Dex on expression of Na+/K+-ATPase in the rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖6 Western blot觀察右美托咪定對各組大鼠Na+/K+-ATPase表達的影響

Figure 7. Effects of Dex on protein level of p-ERK1/2 in rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖7 Western blot觀察右美托咪定對各組大鼠p-ERK1/2蛋白水平的影響

LPS 能夠激活中性粒細胞和肺泡巨噬細胞等炎癥細胞，釋放TNF-α、IL-1β 和IL-6 等大量炎性細胞因子，而IL-10 等抑制性炎癥細胞因子分泌不足，最終導致全身瀑布樣炎癥反應，而肺部最先受到打擊。以往，我們過多關注炎癥反應對毛細血管內(nèi)皮細胞損傷的影響，而對肺泡上皮細胞的影響重視不夠。最近研究發(fā)現(xiàn)：TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥細胞因子能夠抑制肺泡上皮細胞Na+/K+-ATPase 的表達[21-23]。與這些研究結(jié)果一致，我們的研究顯示，LPS 導致肺組織大量中性粒細胞浸潤，且BALF中促炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 明顯增加，雖然抑制性炎癥細胞因子IL-10 分泌增加，但不足以抵抗促炎反應，而Dex 減少了BALF 中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的濃度，同時增加了IL-10 的濃度。以上研究結(jié)果提示，在LPS 誘導的ALI 模型中，Dex 上調(diào)Na+/K+-ATPase 表達可能與抑制炎癥反應相關。

近年來，國內(nèi)外對引起Na+/K+-ATPase 表達和活性變化的相關信號通路進行了相關研究。ERK1/2是絲裂原激活的蛋白激酶信號家族中的重要成員，調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化，并與某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達密切相關。以往的研究表明，ERK1/2 在調(diào)控Na+/K+-ATPase 中扮演重要的角色[24]，研究發(fā)現(xiàn)：甲狀腺激素通過激活ERK1/2 增加鼠肺泡上皮細胞Na+/K+-ATPase 的活性[25-26]，多巴胺通過激活ERK1/2 提高肺泡上皮細胞Na+/K+-ATPase的活性[27]。在人骨骼肌細胞上，Na+/K+-ATPase 的活性也依賴于ERK1/2 的激活[28]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，LPS 抑制p-ERK1/2 的水平，而Dex 治療極大的增加了p-ERK1/2 的蛋白水平，以上這些研究結(jié)果提示在LPS誘導的ALI大鼠模型中，Dex 上調(diào)Na+/K+-ATPase 表達可能與ERK1/2 的激活有關。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Dex 可激活ERK1/2 減輕腦缺血再灌注損傷及心臟缺血再灌注損傷，而給予α2AR 抑制劑后會消除Dex 的保護作用[29-30]，提示Dex可能通過α2AR 介導ERK1/2 的激活而發(fā)揮器官保護作用。我們的研究也得出了類似的結(jié)果，在Dex 和α2AR 抑制劑育亨賓同時干預后，Dex 單獨干預時其抑制肺部炎癥反應，上調(diào)Na+/K+-ATPase 表達及減輕肺水腫的作用被部分逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，Dex 可通過上調(diào)Na+/K+-ATPase 的表達減輕LPS誘導的ALI相關肺水腫，其機制可能與大鼠α2AR介導的ERK1/2激活有關。