張海鵬， 陳 景， 陳秀云， 葉漢深， 李 軍， 張普山， 佘妙容， 李曉紅△

（1廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院輸血科，2廣東省心血管病研究所廣東省華南結(jié)構(gòu)性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，4廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院血液科，廣東廣州510080）

急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種預(yù)后差，生存率低下且容易復(fù)發(fā)的異源性克隆性疾病，其特征在于未成熟髓樣細(xì)胞的增殖和存活增加[1]。AML 是成人白血病常見(jiàn)的分型，患者的年齡越大，預(yù)后越差[2]?；熀彤愺w造血干細(xì)胞移植是當(dāng)前AML 的主要治療方法[3-4]。但老年患者常有多種基礎(chǔ)疾病，且免疫力低下，身體狀況難以支撐整個(gè)療程。中藥不但可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體平衡提高患者免疫力，同時(shí)具有抗腫瘤的作用。和厚樸酚（honokiol）是從木蘭科植物中提取的一種重要的具有生物活性的雙酚類(lèi)化合物，具有包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)特性等多種生物功能[5-6]。研究顯示和厚樸酚可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬或凋亡[7-9]。自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別是通過(guò)種系編碼的激活受體介導(dǎo)的，該受體與DNA 損傷和細(xì)胞應(yīng)激等一些惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞過(guò)程引起的腫瘤細(xì)胞上調(diào)的配體結(jié)合，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。我們前期的研究顯示，白血病細(xì)胞能夠逃逸體內(nèi)NK 細(xì)胞的殺傷，其機(jī)制與其表面自然殺傷細(xì)胞2 族成員D（natural-killer group 2 member D，NKG2D）配體低表達(dá)有關(guān)[10]。KG-1a 細(xì)胞是常用的高表達(dá)CD34 的AML 細(xì)胞株[11]，NK 細(xì)胞對(duì)KG-1a的殺傷能力尚不清楚。因此，本研究擬探討和厚樸酚對(duì)KG-1a 細(xì)胞增殖的抑制作用，及其具體作用機(jī)制是否與提高NKG2D 配體UL16 結(jié)合蛋白（UL16 binding proteins，ULBPs）水平有關(guān)，為AML的治療研究提供參考資料。

材料和方法

1 主要試劑

和厚樸酚購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：110730-201614），純度≥99%；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)于英濰捷基公司；重組人白細(xì)胞介素2（recombinant human interleukin，rIL-2）購(gòu)于PeproTech；DMSO 購(gòu)自Sigma；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）殺傷活性檢測(cè)試劑盒（Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST）購(gòu)自Dojindo；PE Annexin V/7-ADD凋亡檢測(cè)試劑盒I 和小鼠抗人CD3 FITC 購(gòu)自BD；兔抗人ULBP1 抗體、小鼠抗人ULBP3 抗體、小鼠IgG1κ FITC同型對(duì)照和小鼠IgG1κ APC同型對(duì)照購(gòu)自eBioscience；小鼠IgG1κ PE 同型對(duì)照和小鼠抗人CD56 PE（NCAM）購(gòu)自TONBO；小鼠抗人ULBP2 購(gòu)自Sigma；羊 抗兔IgG-PE 購(gòu) 自Santa Cruz；羊 抗小鼠IgG（H+L）購(gòu)自Life Technologies；FALCON 40 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)購(gòu)自BD。KG-1a 細(xì)胞和K562 細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院血液研究室贈(zèng)予；NK-92 細(xì)胞購(gòu)自浙江杭州CTCC。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) KG-1a 細(xì)胞和K562 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，NK-92 細(xì)胞培養(yǎng)于含12.5%胎牛血清、12.5%馬血清和1×105U/L rIL2 的αMEM 培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2常規(guī)條件下培養(yǎng)，每3 d 換液傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 藥物處理及實(shí)驗(yàn)分組 稱(chēng)取20 mg和厚樸酚溶解于1 mL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），終濃度為0.02%。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]，設(shè)8個(gè)劑量組，各組濃度分別為5、10、15、20、25、30、35和40 μmol/L，空白組作為對(duì)照。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK-92 細(xì)胞純度 離心收集NK-92 細(xì)胞，PBS 洗滌，用移液管輕輕吹散重懸于PBS 中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×1010/L，取200 μL 細(xì)胞懸液于5 mL 流式管中，分別加入FITC 標(biāo)記的鼠抗人CD3和PE標(biāo)記的鼠抗人CD56（NCAM），同型對(duì)照是加 入FITC 標(biāo) 記 的 鼠 源IgG1κ 和PE 標(biāo) 記 的 鼠 源IgG1κ。室溫孵育20 min，40 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，流式術(shù)檢測(cè)CD3-CD56+細(xì)胞所占比例。

2.4 CCK8 法測(cè)定和厚樸酚對(duì)KG-1a 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KG-1a 細(xì)胞，制成1×108/L的單細(xì)胞懸液后加入不同體積的和厚樸酚溶液，使每組和厚樸酚濃度分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45 和50 μmol/L；以每孔100 μL 接種于96 孔板，每個(gè)劑量分別設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，并設(shè)正常細(xì)胞作對(duì)照組；培養(yǎng)24 h 后每孔加入10 μL 的CCK8 溶液，37℃避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，波長(zhǎng)450 nm 的酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（absorbance，A），以空白組平均值調(diào)零，根據(jù)A值計(jì)算KG-1a 細(xì)胞相對(duì)活力。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值-本底對(duì)照組A值）/（對(duì)照組A值-本底對(duì)照組A值）×100%。

2.5 LDH 法檢測(cè)NK-92 細(xì)胞對(duì)KG-1a 細(xì)胞的殺傷作用 NK-92 細(xì)胞分別以1∶1、5∶1、10∶1 和20∶1 的效靶比與K562 細(xì)胞或10 μmol/L 和厚樸酚處理前后的KG-1a 細(xì)胞共培養(yǎng)4 h 后，用LDH 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟參考Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST說(shuō)明書(shū)。細(xì)胞損傷率根據(jù)如下公式算出。細(xì)胞損傷率（%）=（實(shí)驗(yàn)組平均值-靶細(xì)胞低對(duì)照平均值-效應(yīng)細(xì)胞低對(duì)照平均值）/（效應(yīng)細(xì)胞高對(duì)照平均值-效應(yīng)細(xì)胞高對(duì)照背景平均值-效應(yīng)細(xì)胞低對(duì)照背景平均值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡 調(diào)整K562 細(xì)胞和KG-1a 細(xì)胞的密度為1×106個(gè)，加入10 μmol/L 和厚樸酚，收集加藥前后的細(xì)胞沉淀，1×PBS 洗滌，隨后加入1 mL 1× Binding Buffer 重懸，吸取100 μL 懸液分別加入20 μL PE Annexin V 和5 μL 7-ADD，室溫避光孵育20 min，用1× Binding Buffer 洗滌重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KG-1a 細(xì)胞表面NKG2D 配體表達(dá) 收集K562細(xì)胞、KG-1a細(xì)胞及經(jīng)10 μmol/L 和厚樸酚處理24 h 的KG-1a 細(xì)胞，200×g離心5 min，PBS 洗滌，吸干凈上清，重懸于200 μL PBS 中，分別加入5 μL 抗體（抗ULBP1、ULBP2 和ULBP3 抗體及同型對(duì)照），室溫避光孵育40 min，用PBS 洗滌，棄去上清后，按照1∶300 濃度加入羊抗兔IgG-PE 和羊抗小鼠IgG（H+L）FITC，室溫避光孵育30 min。用PBS洗去未結(jié)合的抗體后，重懸于200 μL PBS，用40 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 NK-92細(xì)胞的特征

NK-92 細(xì)胞生長(zhǎng)較快，成團(tuán)簇狀生長(zhǎng)，常由各個(gè)小團(tuán)塊融成大的團(tuán)塊，較難打散成單個(gè)細(xì)胞（圖1A）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK-92細(xì)胞的表面標(biāo)志物，顯示CD3-CD56+的細(xì)胞比例為99.24%（圖1B）。

Figure 1. Characteristic of NK-92 cells. A：morphological changes of NK-92 cells observed under light microscope（scale bar=200 μm）；B：surface markers of the cells detected by flow cytometry.圖1 NK-92細(xì)胞的特征

2 KG-1a細(xì)胞對(duì)和厚樸酚的敏感性

CCK8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和厚樸酚干預(yù)24 h 后，隨著和厚樸酚濃度的增加，相對(duì)于5 μmol/L濃度組，其他各濃度的和厚樸酚對(duì)KG-1a 細(xì)胞的殺傷作用顯著提高（P＜0.05），其中25、30、35 和40 μmol/L 的和厚樸酚對(duì)KG-1a 細(xì)胞的殺傷效果相當(dāng)，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 2. The cycotoxicity effect of honokiol at different concentrations on KG-1a cells（dose-response curve）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 5 μmol/L group.圖2 不同濃度的和厚樸酚對(duì)KG-1a 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用（劑量-反應(yīng)曲線）

3 和厚樸酚增強(qiáng)NK-92 細(xì)胞對(duì)KG-1a 細(xì)胞的殺傷力

LDH 法檢測(cè)結(jié)果表明，在相同的效靶比情況下，KG-1a 細(xì)胞對(duì)NK-92 細(xì)胞的殺傷敏感性顯著低于K562 細(xì)胞（P＜0.01）；當(dāng)用10 μmol/L 和厚樸酚處理KG-1a 細(xì)胞24 h 后，NK-92 細(xì)胞對(duì)KG-1a 細(xì)胞的殺傷作用顯著增強(qiáng)，并且隨著效靶比的增加，殺傷效果逐漸增強(qiáng)，在效靶比為1∶1、5∶1、10∶1和20∶1時(shí)殺傷率（用藥前vs用藥后）分別為0.69%±0.17%vs30.26%±0.37%、1.45%±0.18%vs35.02%±0.96%、3.70%±0.04%vs36.00%±0.56%和10.38%±0.06%vs36.44%±0.32%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

4 和厚樸酚增強(qiáng)NK-92 細(xì)胞誘導(dǎo)的KG-1a 細(xì)胞凋亡

選用效靶比5∶1 檢測(cè)NK-92 細(xì)胞對(duì)KG-1a 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，NK-92 細(xì)胞誘導(dǎo)KG-1a細(xì)胞的凋亡率為9.37%±0.14%。使用10 μmol/L 和厚樸酚處理KG-1a 細(xì)胞24 h 后，NK-92細(xì)胞誘導(dǎo)KG-1a 細(xì)胞的凋亡率上升為39.85%±0.65%（P＜0.01），見(jiàn)圖4。這表明10 μmol/L 的和厚樸酚處理KG-1a 細(xì)胞能夠顯著增強(qiáng)NK-92 細(xì)胞誘導(dǎo)的KG-1a細(xì)胞凋亡。

Figure 3. Cytotoxic effects of NK-92 cells on KG-1a cells at different effector-to-target cell ratios（NK-92 cells to KG-1a cells）. The concentration of honokiol was 10 μmol/L. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs KG-1a group.圖3 不同效靶比的NK-92細(xì)胞對(duì)KG-1a細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

5 和厚樸酚上調(diào)KG-1a細(xì)胞的NKG2D配體表達(dá)

流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與K562 細(xì)胞相比較，未經(jīng)處理的KG-1a 細(xì)胞表面的NKG2D 配體ULBP1、ULBP2 和ULBP3 的表達(dá)量顯著較低（P＜0.05）。使用10 μmol/L 的和厚樸酚處理KG-1a 細(xì)胞24 h 后，其表面NKG2D 配體ULBP1、ULBP2 和ULBP3 表達(dá)均比未處理前顯著上調(diào)（P＜0.05，圖5）。

Figure 4. Honokiol（10 μmol/L）significantly enhanced NK-92 cell-induced apoptosis of KG-1a cells. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs KG-1a group.圖4 10 μmol/L和厚樸酚顯著增強(qiáng)NK-92細(xì)胞對(duì)KG-1a細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

討論

本研究顯示NK-92 細(xì)胞對(duì)K562 細(xì)胞的殺傷率隨著效靶比的增高而逐漸增高，提示NK-92 細(xì)胞殺傷力良好。而NK-92 細(xì)胞對(duì)未經(jīng)和厚樸酚處理的KG-1a 細(xì)胞的殺傷作用很低，提示KG-1a 細(xì)胞對(duì)NK-92 細(xì)胞殺傷敏感性低。這可能就是AML 復(fù)發(fā)的原因。在經(jīng)過(guò)和厚樸酚處理后，NK-92細(xì)胞對(duì)KG-1a細(xì)胞殺傷作用顯著提高，提示厚樸酚可以顯著增強(qiáng)NK-92細(xì)胞對(duì)KG-1a細(xì)胞的殺傷作用。

我們的研究結(jié)果顯示KG-1a細(xì)胞表面的NKG2D配體ULBP1、ULBP2和ULBP3的表達(dá)量都很低，這與Chen 等[14]的 研 究 一 致。與 對(duì)NK-92 細(xì) 胞 敏 感 的K562 細(xì)胞相比，NK-92 細(xì)胞對(duì)KG-1a 細(xì)胞的殺傷能力較弱。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示K562 細(xì)胞的NKG2D配體表達(dá)水平高于KG-1a細(xì)胞，這可能是KG-1a細(xì)胞對(duì)NK-92 細(xì)胞殺傷不敏感的原因。而經(jīng)過(guò)和厚樸酚刺激24 h 后，KG-1a 細(xì)胞表面NKG2D 配體ULBP1、ULBP2 和ULBP3 表達(dá)均顯著上調(diào)。KG-1a 細(xì)胞經(jīng)和厚樸酚處理后，再用NK-92 細(xì)胞作用于KG-1a 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)后者的凋亡率比未經(jīng)和厚樸酚處理組明顯升高。這說(shuō)明和厚樸酚可能通過(guò)上調(diào)KG-1a 細(xì)胞表面NKG2D 配體的表達(dá)來(lái)促進(jìn)NK-92細(xì)胞對(duì)KG-1a細(xì)胞的殺傷作用。NK 細(xì)胞是先天免疫所必需的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，其對(duì)癌癥的細(xì)胞毒性由多種激活和抑制受體調(diào)節(jié)。NKG2D是NK-92細(xì)胞表面表達(dá)較多的激活性受體。NKG2D通過(guò)與NKG2D配體相互作用，在NK 細(xì)胞對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視中起關(guān)鍵作用[15]。NKG2D 配體表達(dá)增加可以抑制NF-κB 和PI3K 信號(hào)通路，從而提高NK 細(xì)胞腫瘤免疫治療的效果[16]。研究發(fā)現(xiàn)靶細(xì)胞表達(dá)NKG2D 配體會(huì)刺激NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性IFN 產(chǎn)生，而NKG2D 通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表面的ULBPs 結(jié)合可以起到激活NK 細(xì)胞，從而增強(qiáng)小鼠的抑瘤作用[17]。

Figure 5. The expression levels of NKG2D ligands in different cells. The expression of ULBP1，ULBP2，and ULBP3 in K562 cells and KG-1a cells（with or without honokiol treatment）was detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs KG-1a group.圖5 NKG2D配體在不同細(xì)胞的表達(dá)情況

既往的報(bào)道都是研究和厚樸酚對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接作用，聯(lián)合其他化療藥物或者單獨(dú)使用對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[18-19]，鮮見(jiàn)研究涉及和厚樸酚對(duì)NK 細(xì)胞殺傷毒性的調(diào)控。本研究采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了中藥成分和厚樸酚能增強(qiáng)NK-92 細(xì)胞對(duì)KG-1a 細(xì)胞的殺傷作用，其機(jī)制可能是通過(guò)提高KG-1a 細(xì)胞的NKG2D 配體表達(dá)，從而增加NK-92 細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究體外實(shí)驗(yàn)明確了和厚樸酚對(duì)KG-1a 細(xì)胞的抑制作用，但尚需在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步研究NKG2D 配體上調(diào)后的下游信號(hào)通路變化，為AML的免疫治療提供了參考資料。