法鴻鴿， 李萌陽， 常文光， 肖丹丹， 王建勛△

（青島大學 1基礎醫(yī)學院，2轉化醫(yī)學研究院，山東青島266021）

臨床上，阿霉素（adriamycin；又稱多柔比星，doxorubicin，DOX）作為一種高效的抗腫瘤藥物，被廣泛用于各種腫瘤的治療，例如乳腺癌，肺癌和卵巢癌等[1]。DOX 所引起的嚴重的心臟毒性備受關注，可表現(xiàn)為不可逆的擴張型心肌病和隨之而來的充血性心力衰竭，這會影響腫瘤患者長期的、整體的抗腫瘤治療結果，也使得DOX 的臨床應用受到限制[2]。因此，進一步探究DOX 誘導心肌毒性的分子機制，尋找新的治療或干預靶點將為DOX 的臨床應用提供理論依據(jù)。心肌細胞是終末分化細胞，成熟后分裂和再生能力有限，現(xiàn)有研究表明，心肌細胞凋亡是細胞水平DOX 誘導心肌毒性的主要原因[3-4]，但其分子機制尚未完全闡明。

非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）已被廣泛報道參與了細胞增殖、凋亡、分化和代謝等多種生物學過程，進而在細胞生理和病理過程中發(fā)揮調節(jié)作用[5]。許多研究報道了非編碼RNA 參與心肌細胞凋亡的調控[6-9]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有特殊結構的非編碼RNA，它是由外顯子和/或內含子反向拼接形成的閉合環(huán)形RNA，沒有5"端帽或3"端poly-A 尾巴[10]。在功能上，環(huán)狀RNA 除了能與各種蛋白相互作用外，也具有競爭性結合微小RNA（microRNA，miRNA，miR）的特性，從而抑制了miRNA 對其靶基因的作用[11-12]。此外，一小部分環(huán)狀RNA 仍具備翻譯蛋白的能力[13]。近年來，一些研究表明circRNA 與心血管的發(fā)育和疾病密切相關，例如circASXL1、circCAMSAP1 和circHIPK3 的表達水平升高與胎兒心臟發(fā)育有關，circHRCR 的下調誘導心臟肥大，circMFACR 的上調可誘發(fā)心肌細胞凋亡和心肌梗死[14-16]。此外，circ-Pan3 和circITCH 也在近期被證明參與調控DOX 誘導的心肌毒性[17-18]。盡管關于環(huán)狀RNA 的研究仍處于早期階段，但由于其穩(wěn)定的表達和組織特異性適合用作治療靶點和診斷標記物從而引起了人們的關注。環(huán)狀RNA 在DOX 誘導的心肌毒性中的作用也值得進一步探究。

我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，在心臟中高表達的環(huán)狀RNA NCX1（circNCX1）在缺血性心肌損傷過程中以及氧化應激誘導的心肌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[19]。circNCX1 由細胞凋亡應激誘導，并通過靶向miR-133a-3p促進凋亡，而沉默circNCX1在體內和體外實驗中均能改善心功能并抑制心肌細胞凋亡[19]。但是其在DOX 誘導的心肌毒性中是否有變化還未見報道，本研究旨在探討circNCX1 在DOX 誘導的心肌毒性中的作用，以及其下游的作用靶點。

材料和方法

1 實驗動物及分組

8 周齡的C57BL/6J 雄性小鼠[許可證號：SCXK（魯）2019-0003]被隨機分為2組：實驗組小鼠注射劑量為10 mg/kg 的DOX，每周2 次，共1 周（累計劑量為20 mg/kg）；對照組小鼠注射相應劑量的生理鹽水。最后一次注射后1 周取小鼠心臟組織進行相關分析。所有動物實驗均得到青島大學醫(yī)學部動物護理委員會和使用委員會的批準。

2 細胞、主要試劑和儀器

心肌H9c2 細胞購自上海生命科學研究院。DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自上海依科賽生物技術有限公司；DOX 購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；miR-103 mimic 購自上海吉瑪制藥技術有限公司；轉染試劑Lipofectamine 3000 購自Invitrogen；Trizol 試劑購自Sigma；逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR 試劑購自南京諾唯贊；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣；caspase-3/-7 活性檢測試劑盒購自大連美侖；臺盼藍染料購自北京索萊寶；鏈霉親和素磁珠購自無錫百邁格；生物素探針由華大基因根據(jù)設計合成；所用引物由上海生工和北京擎科生物公司根據(jù)設計合成。倒置熒光顯微鏡購自Olympus；實時熒光定量PCR儀購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 細胞的培養(yǎng)和處理 H9c2 細胞在DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素。細胞放置于37℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，當細胞融合度達到80%～90%時進行傳代。使用2 μmol/L或者0.2 μmol/L的DOX對細胞進行處理。

3.2 細胞轉染 如先前研究[19]所述合成了以pcDNA3.1 為載體的circNCX1 過表達質粒，以及shcircNCX1（序列為5"-AATAGTGTTGGAACAATTGGA-3"），陰性對照序列為5"-ACTACCGTTGTTATAGGTG-3"。miR-103-3p mimic 序 列 為5"-AGCAGCAU UGUACAGGGCUAUGA-3"，陰性對照序列為5"-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3"。依據(jù)試劑的說明，使 用Lipofectamine 3000 進 行質 粒、sh-circNCX1 和miR-103-3p mimic的轉染。

3.3 RT-qPCR 使用Trizol 試劑提取組織和細胞的總RNA，然后根據(jù)說明使用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，miR-103-3p莖環(huán)法反轉錄的引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATAG-3′。將cDNA 在CFX96 實時熒光定量PCR 系 統(tǒng) 進 行 檢 測，使 用2-ΔΔCt公 式 計 算 數(shù) 據(jù)。circNCX1 的表達量以GAPDH 為內參照，miR-103-3p的表達量以U6為內參照，相應的引物序列見表1。

3.4 RNA 成環(huán)驗證 將細胞中的RNA 逆轉錄成cDNA，同時提取細胞的gDNA。分別用正向引物和反向引物將兩組樣本進行普通PCR，擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對向引物序列為F：5′-GACTGTGTCCAACCTGACCTTGATG-3′，R：5′-CACCTCCATGATGCCAATGCTCTC-3′；反向引物序列為F：5′-GAGAGCATTGGCATCATGGAGGTG-3′，R：5′-CATCAAGGTCAGGTTGGACACAGTC-3′。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The primer sequences for RT-qPCR

3.5 TUNEL 染色 細胞接種在1 cm×1 cm 的玻片上并置于24 孔板中，經(jīng)過相應處理后的細胞經(jīng)PBS清洗3 遍，然后加4%多聚甲醛固定。根據(jù)制造商的說明，使用TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒進行染色，然后將細胞放置于含DAPI 染液的介質固定。置于熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞。通過計算TUNEL 陽性細胞核數(shù)量占DAPI 染色核數(shù)量的比例，計算凋亡細胞數(shù)的百分比。

3.6 Caspase-3/-7 活性的檢測 收集處理后的細胞，然后根據(jù)說明，使用caspase-3/-7活性檢測試劑盒對樣本進行caspase-3/-7活性的測定。

3.7 臺盼藍染色 收集處理后的貼壁細胞，然后根據(jù)說明，使用臺盼藍染料染色。使用細胞計數(shù)板于顯微鏡下進行計數(shù)，計算一個視野中臺盼藍染色陽性的細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比。

3.8 RNA pull-down 實驗 用1%無RNA 酶的BSA和0.5 g/L酵母tRNA預處理鏈霉親和素磁珠，4℃翻轉3 h。分別將circNCX1 的生物素探針5"-bio-GAGACTTCCAATTGTTCCAACACTATTTCATCATTC-3" 和對照探針5"-bio-TGATGTCTAGCGCTTGGGCTTTG-3"與磁珠混合孵育，4℃翻轉3 h。細胞經(jīng)PBS 清洗后，用制備的冰浴裂解液[20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），200 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，6×104U/L RNA 酶抑制劑，1 mmol/L DTT，蛋白酶抑制劑]750 μL 將細胞刮下來，4℃翻轉裂解3 h，然后1 000×g、4℃離心5 min。取上清中的50 μL作為input，剩余的上清分成兩管，然后4℃翻轉3 h 使裂解物和探針-磁珠復合物結合。使用冰浴的高鹽緩沖液[0.1%SDS，1% TritionX-100，2 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），500 mmol/L NaCl]洗滌3次，低鹽緩沖液（0.1% SDS，1% Trition X-100，2 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 mmol/L NaCl]洗滌1 次。然后用Trizol 提取磁珠與RNA 的復合物，通過RT-qPCR檢測miR-103-3p的表達量。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間數(shù)據(jù)運用t檢驗進行比較；多組均數(shù)間的比較運用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間的兩兩比較運用Tukey"s 事后檢驗進行比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 DOX能夠誘導circNCX1的表達上調

首先，分別使用circNCX1 的對向引物和反向引物對H9c2 細胞的cDNA 和gDNA 進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳的條帶顯示對向引物能夠同時擴增cDNA和gDNA，而反向引物只能擴增cDNA，表明circNCX1是反向拼接形成的環(huán)狀結構（圖1A）。為檢測circNCX1 表達 量 的 變 化，使 用2 μmol/LDOX 處 理H9c2 細胞相應的時間（0、3、6、12 和24 h），RT-qPCR結果顯示，circNCX1在DOX誘導的H9c2細胞中呈時間依賴性上升（P＜0.05），見圖1B。此外，相比于對照組，注射DOX 的小鼠心肌組織中circNCX1 的表達量明顯升高（P＜0.05），見圖1C。因此，在DOX 誘導的心肌細胞和心臟組織中circNCX1表達上調。

2 沉默circNCX1 可降低DOX 誘導的心肌細胞凋亡率

之前研究表明，circNCX1 在心肌氧化應激過程中發(fā)揮促進心肌細胞凋亡的作用。因此，我們推測在DOX 作用心肌的過程中，circNCX1可能發(fā)揮相似的作用。為證明這一推測，我們首先使用特異性靶向circNCX1 連接區(qū)域的shRNA（sh-circNCX1）來沉默circNCX1在H9c2細胞中的表達（圖2A）。接下來，使用2 μmol/L 的DOX 誘導已經(jīng)轉染過sh-circNCX1的H9c2 細胞24 h。TUNEL 染色的結果表明，沉默circNCX1能夠明顯減少DOX 誘導的心肌細胞凋亡（圖2C）。此外，凋亡關鍵蛋白caspase-3/-7 活性的檢測結果同樣顯示，沉默circNCX1顯著抑制了DOX 引起的caspase-3/-7 活性增強（圖2D）。相反的，使用低DOX（0.2 μmol/L）誘導已經(jīng)轉染過circNCX1 過表達質粒的H9c2 細胞24 h。臺盼藍染色顯示，過表達circNCX1（圖2B）進一步增加了低濃度DOX 處理下的細胞死亡率（圖2E）。以上結果顯示，circNCX1促進了DOX 誘導的心肌細胞凋亡，而沉默circNCX1可以有效抑制心肌細胞凋亡。

Figure 1. circNCX1 was up-regulated in DOX-treated H9c2 cells and mouse hearts. A：circNCX1 was a back-splicing formed loop in structure；B：the circNCX1 levels in H9c2 cells under 2 μmol/L DOX treatment with indicated times；C：the circNCX1 levels was increased in DOX-treated mouse heart tissues. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs 0 h group；#P＜0.05 vs control group.圖1 DOX誘導circNCX1的表達上調

3 circNCX1與miR-103-3p相互作用

據(jù)報道，由外顯子形成的circRNA 可以充當miRNA 的海綿，以抑制其在細胞質中的活性[20]。在先前的一篇報道中，作者通過miRNA 微陣列分析篩選了可能與circNCX1 結合的752 個miRNA[21]。在此基礎上，我們運用了生物信息學軟件，預測出了circNCX1 與miR-103-3p 的3 個不同的結合位點（圖3A），表明circNCX1 與miR-103-3p 之間可能存在直接的相互作用。為了驗證這一預測，我們進行了RNA pull-down 實驗，觀察到與陰性對照相比，circNCX1 的生物素探針能夠富集更多的miR-103-3p（圖3B）。此外，我們過表達circNCX1，檢測到miR-103-3p 的表達量下調，而沉默circNCX1 則促進了miR-103-3p 的表達（圖3C、D）。以上實驗說明，circNCX1 能夠直接結合miR-103-3p，并且抑制其表達。

4 miR-103-3p過表達可抑制心肌細胞凋亡

DOX誘導的小鼠的心臟組織中miR-103-3p的表達下調（圖4A）。我們同樣使用2 μmol/LDOX 處理H9c2 相應的時間，RT-qPCR 結果顯示，miR-103-3p的表達隨時間延長而梯度下降（圖4B），因此，我們推測miR-103-3p 在DOX 作用心肌過程中發(fā)揮保護作用。在有效的過表達miR-103-3p 的基礎上（圖4C），我們分別檢測了caspase-3/-7 的活性和細胞死亡數(shù)（臺盼藍染色）。結果顯示，在DOX 誘導下，過表達miR-103-3p 能顯著抑制caspase-3/-7 的活性，并且減少細胞死亡（圖4D、E）。此外，在使用低濃度DOX（0.2 μmol/L）誘導H9c2 時，共轉染circNCX1 過表達質粒和miR-103-3p mimic 組心肌細胞凋亡率明顯較過表達circNCX1 組細胞凋亡率減少（圖4F）。這些結果說明，miR-103-3p 具有抗DOX 誘導的心肌細胞凋亡的作用，且作用與circNCX1的交互作用有關。

討論

隨著RNA 測序技術的發(fā)展，環(huán)狀RNA 得到廣泛鑒定，此外，大量研究證實了環(huán)狀RNA 的基因調控功能[22-23]。迄今為止，已報道了環(huán)狀RNA 參與心血管發(fā)育和疾病。這些circRNA 中的某些在心臟?。òㄐ牧λソ?，心臟梗塞和心臟肥大等）中表現(xiàn)出異常的表達和調節(jié)活性，這些發(fā)現(xiàn)為指導疾病治療和診斷提供新策略[11，24-26]。作為環(huán)狀RNA 最主要的功能之一，其可以充當miRNA 海綿，與miRNA 目標位點競爭結合，以抑制miRNA 活性并參與miRNA 介導的轉錄后調控。例如最先報道這一功能的circRNA CDR1as/ciRS-7，它具有63 個保守的miR-7 結合位點，能通過結合miR-7調節(jié)大腦發(fā)育[12，22]。

Figure 2. Knock-down of circNCX1 attenuated DOX-induced apoptosis of the H9c2 cells. The expression level of circNCX1 in the H9c2 cells transfected with sh_circNCX1 vector（A）and the circNCX1 expression vector（B）were detected；C：apoptosis was tested by the TUNEL assay（green：TUNEL-positive nuclei；blue：DAPI-stained nuclei；scale bar=20 μm）；D：the activity of caspase-3/-7 was tested；E：the percentage of cell death was quantitatively analyzed. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；▲P＜0.05 vs scrambled control group；△P＜0.05 vs empty vector group；#P＜0.05 vs DOX group.圖2 敲減circNCX1表達抑制DOX誘導的心肌細胞凋亡

Figure 3. circNCX1 interacted with miR-103-3p. A：putative binding sites of circNCX1 and miR-103-3p；B：the relevant enrichment of pulled-down miR-103-3p levels by circNCX1 probe or control probe. The expression levels of miR-103-3p with transfection of the circNCX1 expression vector（C）and the sh_circNCX1 vector（D）were detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs biotin-random group；△P＜0.05 vs empty vector group；#P＜0.05 vs scrambled control group.圖3 circNCX1與miR-103-3p相互作用的驗證

circNCX1是從Ncx1基因的第2個外顯子轉錄的環(huán)狀RNA，它在心臟中大量表達，并在心肌病中顯示出顯著的差異表達水平。RT-qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)，circNCX1 在DOX 誘導的H9c2 細胞和小鼠心肌組織中表達上升，提示circNCX1 可能參與調控DOX 誘導的心肌毒性。接下來的功能實驗顯示，沉默circNCX1可以減少DOX 誘導的H9c2 細胞凋亡。相反，過表達circNCX1 增加了DOX 誘導的心肌細胞死亡數(shù)。這些結果說明circNCX1 促進DOX 誘導的心肌細胞凋亡。生物信息學預測了circNCX1 與miR-103-3p 存在結合3 個位點。RNA pull-down 實驗證明了circNCX1 能夠明顯的富集H9c2 細胞中的miR-103-3p。

已有多篇文獻報道了miR-103-3p對細胞凋亡具有重要作用。脂多糖誘導PC12 細胞損傷模擬脊髓損傷的病理過程中，miR-103-3p 過表達顯著提高了細胞活力，減少了細胞凋亡和自噬[27]。在阿爾茨海默病中，circ_0000950 通過對miR-103-3p 的海綿作用，抑制了miR-103-3p的表達，進而促進了神經(jīng)元細胞凋亡[28]。此外，miR-103-3p 可以減輕肝臟損傷，包括組織損傷和線粒體損傷，抑制炎癥因子的分泌，并減少了肝細胞的凋亡[29]。在心血管系統(tǒng)中，miR-103-3p 也參與了心臟疾病的調節(jié)。在氧化應激的人臍靜脈內皮細胞中，過表達miR-103-3p 通過介導BNIP3 的下調抑制活性氧簇的產(chǎn)生，起到細胞保護作用[30]。miR-103-3p 可以通過抑制壓力超負荷大鼠心臟中的TRPV3 信號傳導來降低心肌細胞自噬活性，從而部分減輕心肌肥大[31]。然而，在心肌壞死的機制研究中，miR-103-3p 可以通過靶向FADD 促進H9c2細胞的RIPK1和RIPK3依賴性壞死[32]。在本研究中，我們證明了在DOX 誘導的H9c2 細胞中，miR-103-3p 的表達量呈時間依賴性下降，而過表達miR-103-3p 能夠抑制DOX 誘導的H9c2 細胞凋亡，并且miR-103-3p是作為circNCX1的下游發(fā)揮功能的。然而，在DOX誘導的心肌損傷中，miR-103-3p的下游靶標仍不清楚，其具體的作用機制將是我們下一步研究的方向。此外，miR-103-3p 在心肌細胞中所表現(xiàn)出的保護作用和促進細胞死亡的作用仍沒有一致的結論，這可能是因為miR-103-3p 參與了不同信號通路的調節(jié)，因此值得我們進一步探索。

綜上所述，本研究表明circNCX1 在DOX 誘導的H9c2 細胞和小鼠的心肌組織中表達明顯上調。沉默circNCX1可通過調節(jié)與其直接結合的miR-103-3p發(fā)揮抗心肌細胞凋亡的作用。

Figure 4. circNCX1 increased the apoptosis of H9c2 cells by inhibiting miR-103-3p. A：the miR-103-3p level was decreased in DOX-treated mouse heart tissues（n=5）；B：the miR-103-3p level in the H9c2 cells under 2 μmol/L DOX treatment for indicated time（n=3）；C：the expression level of miR-103-3p in H9c2 cells with transfection of miR-103-3p mimic（n=3）；D：the activity of caspase-3/-7 was tested（n=3）；E，F(xiàn)：the percentage of cell death was quantitative analyzed（n=3）.Mean±SD. *P＜0.05 vs control group；▲P＜0.05 vs 0 h group；#P＜0.05 vs negative control group；@P＜0.05 vs DOX（2 μmol/L）+negative control group；^P＜0.05 vs DOX（0.2 μmol/L）group；&P＜0.05 vs DOX（0.2 μmol/L）+negative control+circNCX1 group.圖4 circNCX1靶向miR-103-3p，進而調控心肌細胞凋亡