楊 蕙， 王宇紅， 杜 青， 柳 卓， 羅薇絮， 趙洪慶

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙410206；3湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南長(zhǎng)沙410006）

臨床研究和meta 分析認(rèn)為，糖尿病和抑郁癥互為患病率增加的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，可雙向誘發(fā)疾病發(fā)生或加重[1]。由于世界范圍內(nèi)糖尿病患者數(shù)量逐年遞增，故并發(fā)抑郁癥的概率也在逐漸升高，尤其是在中等發(fā)達(dá)及欠發(fā)達(dá)國(guó)家[2]。但是，有關(guān)該疾病的發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)研究卻較少。左歸降糖解郁方是在經(jīng)典名方左歸丸的基礎(chǔ)上加減而成，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的降糖調(diào)脂、改善動(dòng)物抑郁樣行為的作用[3]，且對(duì)外周和中樞胰島素抵抗均具有較好的調(diào)節(jié)作用[4]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）可作用于多種底物蛋白而參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、自噬、氧化應(yīng)激、炎癥等病理生理過(guò)程[5-6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，其可通過(guò)保護(hù)胰島β 細(xì)胞、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等參與調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而抑制糖尿病及糖尿病引起的器官功能損傷，并被視為糖尿病及其并發(fā)癥治療新靶點(diǎn)[7-9]。在腦內(nèi)，SIRT1作為胰島素信號(hào)的重要下游，可被胰島素信號(hào)激活，并通過(guò)雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物（target of rapamycin complex 1，TORC1）增強(qiáng)環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）的轉(zhuǎn)錄功能，增加腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neuotrophic factor，BDNF）的表達(dá)，參與神經(jīng)生長(zhǎng)并調(diào)節(jié)神經(jīng)行為。我們的前期研究已經(jīng)明確，左歸降糖解郁方可通過(guò)增加海馬BDNF 的表達(dá)而緩解糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的抑郁樣行為[10]。但其是否通過(guò)調(diào)控SIRT1/TORC1 信號(hào)而上調(diào)BDNF 表達(dá)，尚未可知。故本文擬運(yùn)用SIRT1 的激動(dòng)劑和抑制劑，探究SIRT1/TORC1 信號(hào)通路與左歸降糖解郁方調(diào)控糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬BDNF表達(dá)的相關(guān)性。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠（190～210 g）購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0004。實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物房中，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，動(dòng)物自由攝食及飲水。

左歸降糖解郁方組成為：黃芪18 g，貫葉連翹3 g，姜黃9 g，熟地黃15 g，山茱萸12 g，枸杞12 g，菟絲子9 g，杜仲9 g，丹參12 g，丹皮6 g，牛膝9 g。方中各藥均購(gòu)自于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并于醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中心制備為水煎液，生藥濃度為1.14 kg/L。SRT2104和sirtinol購(gòu)自MedChemExpress；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購(gòu)自Solarbio；抗SIRT1 單克隆抗體購(gòu)自Affinity Biosciences；抗TORC1、p-CREB、CREB 和BDNF 多克隆抗體購(gòu)自Proteintech；抗GAPDH 多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；增強(qiáng)型BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自Absin；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自新賽美生物科技有限公司；高爾基染液套裝購(gòu)自Servicebio。Western blot 系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad；正置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本尼康。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的制備及分組 動(dòng)物給予2 周高脂（high-fat diet，HFD）灌胃后進(jìn)行一次性STZ 尾靜脈注射（38 mg/kg），隨后再施加4 周慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）形成糖尿病并發(fā)抑郁癥動(dòng)物模型[11]。首先，將模型動(dòng)物分為4 組，并設(shè)立健康對(duì)照：糖尿病并發(fā)抑郁癥模型（model-1）組、高劑量（20.52 g/kg）左歸降糖解郁方（ZJJ-H）組、中劑量（10.26 g/kg）左歸降糖解郁方（ZJJ-M）組、低劑量（5.13 g/kg）左歸降糖解郁方（ZJJL）組和對(duì)照（control）組。其次，給予糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬腦區(qū)注射SIRT1 激動(dòng)劑和抑制劑干預(yù)[12]，并設(shè)立假手術(shù)對(duì)照和健康對(duì)照：SIRT1 激動(dòng)劑（SRT2104）組、SIRT1抑制劑（sirtinol）組、疾病模型假手術(shù)（model-2）組和對(duì)照（control）組。最后，給予糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠高劑量左歸降糖解郁方灌胃的同時(shí)注射SIRT1 抑制劑：疾病模型假手術(shù)（model-2）組、高劑量左歸降糖解郁方（ZJJ）組和高劑量左歸降糖解郁方灌胃聯(lián)合SIRT1 抑制劑干預(yù)（ZJJ-sirtinol）組。其中，左歸降糖解郁方從CUMS 造模開始時(shí)給藥直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共給藥28 d；SIRT1 的激動(dòng)劑（SRT2104）和抑制劑（sirtinol）均從CUMS 造模的第3周開始直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共給藥14 d，給藥濃度均為10 μmol/L[13]。

2.2 動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè) 本文采用懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的抑郁樣行為進(jìn)行評(píng)價(jià)。懸尾實(shí)驗(yàn)是將動(dòng)物尾部懸掛于金屬掛鉤上使動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持倒掛。實(shí)驗(yàn)一共持續(xù)3.5 min，前30 s 為適應(yīng)時(shí)間，后3 min 為實(shí)驗(yàn)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中統(tǒng)計(jì)動(dòng)物的不動(dòng)時(shí)間，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是將動(dòng)物置于一個(gè)高為40 cm，直徑為20 cm 的圓柱形玻璃缸內(nèi)，水位以動(dòng)物伸展全身后尾部不碰觸缸底為準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)共持續(xù)4 min，前1 min 為適應(yīng)時(shí)間，后3 min 為實(shí)驗(yàn)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)以動(dòng)物不動(dòng)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中均保證同期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間不可見，以減少動(dòng)作干擾。

2.3 血糖檢測(cè)及胰島素抵抗評(píng)價(jià) 各組大鼠在行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后禁食12 h，麻醉取腹主動(dòng)脈血。按照1 200 r/min 離心10 min 后取上層血漿，并按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)動(dòng)物空腹血糖及胰島素含量。外周胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖含量（mmol/L）×胰島素含量（mU/L）/22.5。

2.4 高爾基染色 冰上取大鼠腦組織置于固定液中固定72 h，隨后切成厚度為3 mm 的組織塊。用生理鹽水將腦組織輕輕漂洗，置于EP 管中，加入高爾基染液將腦組織完全浸沒(méi)，放置陰涼通風(fēng)處避光14 d（浸泡48 h 后，換1 次新染液，之后每隔3 d 換1 次新染液，共計(jì)14 d）。將樣本取出，置于15%的蔗糖溶液中低溫避光脫水1 d，取出組織塊；再置于30%的蔗糖溶液中低溫避光脫水2 d。隨后，蒸餾水洗1 min，濃氨水（浸沒(méi)組織）處理45 min，蒸餾水洗1 min，酸性堅(jiān)膜定影液（浸沒(méi)組織）處理45 min，蒸餾水洗1 min。最后，將樣本置于30%的蔗糖溶液中低溫避光脫水3 d，采用OCT 包埋，并切為100 μm 的腦切片，常溫避光保存過(guò)夜后，浸入純水20 s，用濾紙擦干組織周邊多余的水分后，甘油明膠封片。攝片后采用ImageJ分析樹突棘數(shù)量。

2.5 Western blot檢測(cè) 將腦海馬樣本轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。檢測(cè)時(shí)，將樣本置于蛋白裂解液中，并加入磷酸化酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。冰上研磨均勻后靜置2 h離心取上清，并用BCA蛋白濃度試劑盒進(jìn)行蛋白定量。制備凝膠，樣本蛋白變性后上樣進(jìn)行SDS-PAGE。隨后，在濕式轉(zhuǎn)膜裝置中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉2 h，并分別加入抗SIRT1、TORC1、p-CREB、CREB 和BDNF 抗體稀釋液（1∶1 000），4℃過(guò)夜后洗膜并加入Ⅱ抗（1∶3 000），室溫孵育1 h。洗膜后用ECL 進(jìn)行顯色。采用ImageJ 軟件對(duì)所有蛋白條帶進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0。所有指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 左歸降糖解郁方降低模型大鼠血糖并改善外周胰島素抵抗

與對(duì)照組比較，模型組大鼠的血糖和外周胰島素抵抗指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；與模型組大鼠相比，高劑量和中劑量左歸降糖解郁方組大鼠血糖和外周胰島素抵抗指數(shù)均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），而低劑量組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；高劑量左歸降糖解郁方對(duì)模型大鼠血糖和胰島素抵抗的改善作用要顯著優(yōu)于低劑量（P＜0.01），而中劑量對(duì)大鼠胰島素抵抗的作用優(yōu)于低劑量（P＜0.05），見表1。

2 左歸降糖解郁方減少模型大鼠的抑郁樣行為

與對(duì)照組比較，模型組大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間均明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量左歸降糖解郁方可顯著減少大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間（P＜0.01）；而中劑量組大鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)實(shí)驗(yàn)明顯縮短（P＜0.05），但在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，低劑量組大鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中的差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；高劑量左歸降糖解郁方對(duì)大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的改善作用明顯優(yōu)于低劑量（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

表1 左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠血糖、胰島素抵抗指數(shù)和抑郁樣行為的影響Table 1. Effect of Zuogui-Jiangtang-Jieyu decoction（ZJJ）on blood glucose，insulin resistance and depression-like behaviors of the diabetic rats with depression（Mean±SEM. n=8）

3 左歸降糖解郁方增加模型大鼠海馬的樹突棘密度

與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬樹突棘密度顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量和中劑量左歸降糖解郁方組大鼠的樹突棘密度顯著增加（P＜0.01），而低劑量左歸降糖解郁方則對(duì)模型大鼠海馬樹突棘密度沒(méi)有顯著性影響（P＞0.05）；與低劑量左歸降糖解郁方組比較，高劑量組和中劑量組海馬樹突棘密度的增加更為顯著（P＜0.05 或P＜0.01），見圖1。

Figure 1. Effect of Zuogui-Jiangtang-Jieyu decoction（ZJJ）on spine density of hippocampal neurons in diabetic rats with depression（scale bar=50 μm）. Mean±SEM. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs model-1 group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs ZJJ-L group.圖1 左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠海馬樹突棘密度的影響

4 左歸降糖解郁方對(duì)SIRT1/TORC1 信號(hào)的調(diào)節(jié)作用

與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬SIRT1 和TORC1 的表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量左歸降糖解郁方可顯著升高模型大鼠海馬SIRT1 和TORC1 的表達(dá)（P＜0.01），中劑量?jī)H顯著上調(diào)海馬SIRT1 的表達(dá)（P＜0.05），而低劑量對(duì)上述蛋白則無(wú)顯著的調(diào)節(jié)作用（P＞0.05）；高劑量左歸降糖解郁方對(duì)SIRT1/TORC1信號(hào)的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于低劑量（P＜0.05或P＜0.01），見圖2。

5 激活SIRT1/TORC1 信號(hào)增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)及樹突棘密度

與模型組比較，SIRT1 激動(dòng)劑可顯著提高海馬TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平（P＜0.05 或P＜0.01）；SIRT1 抑制劑可顯著降低海馬BDNF 的表達(dá)（P＜0.01），但對(duì)TORC1 和p-CREB 蛋白水平無(wú)顯著影響（P＞0.05）；與SIRT1 抑制劑比較，SIRT1 激動(dòng)劑可顯著提高TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平（P＜0.01）；與模型組比較，SIRT1 激動(dòng)劑可顯著增加模型大鼠海馬樹突棘密度（P＜0.01），而其抑制劑對(duì)樹突棘密度未見顯著影響（P＞0.01）；與SIRT1 抑制劑比較，其激動(dòng)劑可顯著增加海馬樹突棘的密度（P＜0.05），見圖3。

6 左歸降糖解郁方調(diào)控SIRT1/TORC1 信號(hào)增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用及樹突棘密度

Figure 2. Effect of Zuogui-Jiangtang-Jieyu decoction（ZJJ）on SIRT1/TORC1 signaling pathway in hippocampus of diabetic rats with depression. Mean±SEM. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model-1 group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs ZJJ-L group.圖2 左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠海馬SIRT1/TORC1信號(hào)的影響

Figure 3. Effects of the SIRT1 activator and inhibitor on neurotrophy and spine density of hippocampal neurons in diabetic rats with depression. A：the protein levels of TORC1，p-CREB and BDNF in the hippocampus；B：the spine density of hippocampal neurons（scale bar=50 μm）. Mean±SEM. n=4. **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model-2 group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs sirtinol group.圖3 SIRT1激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和樹突棘的作用

與模型組比較，高劑量左歸降糖解郁方可顯著提高模型大鼠海馬TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平及樹突棘密度（P＜0.05或P＜0.01）；與高劑量左歸降糖解郁方組比較，SIRT1 抑制劑可顯著減弱左歸降糖解郁方對(duì)模型大鼠海馬TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平及樹突棘密度的提高作用（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. Effects of the Zuogui-Jiangtang-Jieyu decoction（ZJJ）on neurotrophy and spine density of hippocampal neurons via SIRT1/TORC1 signaling pathway. A：the protein levels of TORC1，p-CREB and BDNFin the hippocampus；B：the spine density of hippocampal neurons（scale bar=50 μm）. Mean±SEM. n=4. #P＜0.05，##P＜0.01 vs model-2 group；&P＜0.05 vs ZJJ group.圖4 左歸降糖解郁方調(diào)控SIRT1/TORC1信號(hào)改善神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和海馬樹突棘密度

討論

本實(shí)驗(yàn)所用復(fù)方左歸降糖解郁方是依據(jù)糖尿病并發(fā)抑郁癥的“虛、淤、郁”中醫(yī)病機(jī)[14]，以疏肝解郁、活血化瘀為治法，在經(jīng)典名方左歸丸的基礎(chǔ)上加減而得。方中熟地為君，滋養(yǎng)腎陰；山茱萸和枸杞為臣，合君藥以加強(qiáng)滋補(bǔ)腎陰作用；佐以菟絲子、牛膝和杜仲補(bǔ)肝腎，黃芪健脾益氣，丹參和丹皮活血散瘀，姜黃和貫葉連翹化瘀行氣、疏肝解郁。全方共奏疏肝解郁、活血化瘀之功效。實(shí)驗(yàn)可見，左歸降糖解郁方可有效降低糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠外周血糖并減輕胰島素抵抗，同時(shí)在經(jīng)典的動(dòng)物抑郁行為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)——懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中均可見左歸降糖解郁方的抗抑郁作用。上述結(jié)果與之前的研究保持一致[15]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方可有效改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元的胰島素信號(hào)，從而改善細(xì)胞供能[4]。事實(shí)上，胰島素信號(hào)在腦內(nèi)不僅調(diào)節(jié)神經(jīng)元的能量代謝，還可通過(guò)影響神經(jīng)元樹突的形成和生長(zhǎng)，參與調(diào)節(jié)動(dòng)物的神經(jīng)行為。我們通過(guò)Golgi-Cox 染色研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬樹突棘密度顯著降低，高劑量和中劑量左歸降糖解郁方均明顯減輕海馬的上述損傷。由于樹突棘密度改變可直接影響突觸的傳遞功能，而海馬中樹突棘密度降低所導(dǎo)致的突觸可塑性下降又與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)[16-17]。因此推測(cè)，左歸降糖解郁方減少糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的抑郁樣行為可能與其調(diào)控樹突棘密度相關(guān)。

近年來(lái)，腦胰島素抵抗被認(rèn)為是糖尿病和抑郁癥之間的重要聯(lián)系，且以胰島素信號(hào)異常為主要表現(xiàn)形式[18]。已有較多研究表明，腦胰島素信號(hào)異?？蓪?dǎo)致海馬樹突棘密度降低、數(shù)量減少等形態(tài)損傷，并引發(fā)抑郁樣行為和學(xué)習(xí)記憶減退等表現(xiàn)[19]，但其分子機(jī)制尚未完全清楚。SIRT1 是胰島素信號(hào)的重要下游分子，同時(shí)也是最新發(fā)現(xiàn)的抑郁癥靶標(biāo)[20]。當(dāng)腦內(nèi)發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）酪氨酸位點(diǎn)磷酸化水平降低，可通過(guò)下調(diào)AMPK活性導(dǎo)致SIRT1的脫乙酰能力被抑制，從而使SIRT1 介導(dǎo)TORC1 固定位點(diǎn)的賴氨酸殘基脫乙?；?，SIRT1/TORC1 信號(hào)通路被抑制[21]。本研究中，左歸降糖解郁方可顯著升高糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬中下調(diào)的SIRT1 和TORC1 蛋白水平，提示了其對(duì)SIRT1/TORC1 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。此外，由于SIRT1基因敲除小鼠海馬可見突觸可塑性降低及樹突分支減少，并被認(rèn)為與SIRT1 蛋白的催化活性缺失有關(guān)[22]，故進(jìn)一步推測(cè)，左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬樹突棘的改善作用可能與其調(diào)節(jié)SIRT1/TORC1信號(hào)通路有關(guān)。事實(shí)上，也有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1 可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）表達(dá)影響慢性應(yīng)激大鼠的抑郁樣行為[13]，或是通過(guò)干預(yù)過(guò)氧化物酶增殖體激活受體γ 輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α）的脫乙?；绊懮窠?jīng)元的谷氨酸毒性，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁樣行為的發(fā)生[23]。故左歸降糖解郁方調(diào)節(jié)SIRT1 蛋白、減少糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠抑郁樣行為的下游分子機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)對(duì)于樹突棘的生長(zhǎng)非常重要，研究發(fā)現(xiàn)BDNF 可促進(jìn)樹突棘的增加。而TORC1 作為一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子，可通過(guò)增強(qiáng)CREB 的轉(zhuǎn)錄功能，增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF 的表達(dá)[24]。在本研究中，我們對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠分別注射了SIRT1 的激動(dòng)劑和抑制劑。結(jié)果顯示，SIRT1 激動(dòng)劑可顯著提高疾病模型大鼠海馬中TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平，且顯著增加海馬樹突棘密度，即激活糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬SIRT1/TORC1信號(hào)可通過(guò)增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)而提高樹突棘的密度；而SIRT1 抑制劑對(duì)模型大鼠海馬樹突棘密度及TORC1 和p-CREB 蛋白水平無(wú)顯著影響。推測(cè)造成上述結(jié)果的原因可能是糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠本身就存在海馬TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白的顯著下調(diào)和樹突棘密度的降低，導(dǎo)致抑制劑的作用在疾病背景下不能表現(xiàn)出來(lái)。而該推測(cè)可進(jìn)一步通過(guò)研究SIRT1 抑制劑對(duì)正常大鼠的影響進(jìn)行驗(yàn)證。

為進(jìn)一步研究左歸降糖解郁方調(diào)控SIRT1/TORC1信號(hào)通路影響海馬樹突棘的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)選擇了對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬SIRT1/TORC1信號(hào)通路作用最顯著的高劑量左歸降糖解郁方進(jìn)行研究。與高劑量左歸降糖解郁方干預(yù)的單一措施相比，SIRT1 抑制劑可顯著減弱高劑量左歸降糖解郁方對(duì)大鼠海馬TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平及樹突棘密度的提高作用。該結(jié)果進(jìn)一步明確了左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬SIRT1/TORC1 信號(hào)的作用，同時(shí)提示其可能通過(guò)調(diào)控SIRT1/TORC1 信號(hào)通路而增強(qiáng)海馬BDNF 的表達(dá)。

綜上所述，本研究認(rèn)為左歸降糖解郁方可干預(yù)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬SIRT1/TORC1 信號(hào)通路，并可能通過(guò)增強(qiáng)海馬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)而提高神經(jīng)元的樹突棘密度，從而發(fā)揮抗抑郁的作用。