張喜奎 林祥發(fā) 馬 來 王旭麗 李靈輝 朱為坤

慢性腎衰竭是各種慢性腎臟病引起腎單位不可逆性破壞，以致殘存腎單位不足以充分排除代謝廢物及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的病理過程，從中醫(yī)學理論這一層面上來看，與“關格”非常相似。筆者臨床上運用桃核承氣湯加減化裁治療慢性腎衰竭中取得確切療效，但分子生物學機理尚未闡明。在這樣的背景下，本研究將5/6腎切除大鼠作為實驗模型，研究桃核承氣湯延緩慢性腎衰竭的機理。

1 材料與方法

實驗材料本研究，以125只大鼠為實驗對象，大鼠的體質(zhì)量波動在180～200 g。按照隨機方式進行分籠，提供標準飼料、超純水進行喂養(yǎng)，1周后開始實驗。主要藥物和試劑：①桃核承氣湯：本校附屬第二人民醫(yī)院開具飲片，經(jīng)過煎煮之后，形成濃縮液。②尿毒清顆粒。③注射用青霉素鈉：80萬U/支，魯抗制藥生產(chǎn)。④Wnt1抗體Abcam Number:ab15251；Axin CST Number:3323；β-catenin抗體Number:51067-2-AP；β-actin抗體 Number:660091-1g。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模將125只大鼠按照相同的方式飼養(yǎng)7 d后，按照隨機方式進行分組。對模型組、尿毒清組、核桃承氣湯組的大鼠，將5/6腎切除，實施手術造模。根據(jù)體質(zhì)量估算麻醉劑量，禁食不禁水12 h，防止麻醉狀態(tài)誤吸；在腹腔部位注入水合氯醛，待麻醉藥發(fā)揮作用后，立即手術；首次手術沿著左腎肋脊角將左腎位置確定，備皮，利用碘伏進行消毒處理，使用組織剪依序分離皮膚、肌肉，打開腹腔剪除所需腎組織用止血海綿按壓止血后逐層縫合；完成手術之后，連續(xù)3 d在腹腔注射青霉素，達到預防感染的效果；在手術之后的第7天，結扎并剪除右腎。假手術組分次剝離大鼠雙腎被膜。造模后經(jīng)眼底采血，觀察血尿素氮、血肌酐變化，若明顯升高，則說明造模成功[1，2]。

1.2.2 灌胃每日上午9:00將藥物放在EP管中，經(jīng)過恒溫水浴處理后進行灌胃，桃核承氣湯組飲片煎煮后濃縮液進行灌胃；對尿毒清組的大鼠，利用溫水溶解顆粒后的混懸液進行灌胃；對剩下3組的大鼠，灌以等量生理鹽水，持續(xù)時間為56 d，每隔7 d稱重，如實記錄體質(zhì)量，了解體質(zhì)量變化情況，及時調(diào)整灌胃劑量。

1.2.3 標本采集第57天，麻醉后經(jīng)腹主動脈采集血液檢測血肌酐、血尿素氮、血紅蛋白、紅細胞計數(shù)；取腎組織，50%腎組織進行HE病理染色；剩下50%對半切開分置凍存管，用于Wb、PCR檢測。

1.3 觀察內(nèi)容

1.3.1 一般情況精神表現(xiàn)、大鼠毛發(fā)、靈敏度等，每隔7 d稱重，如實記錄體質(zhì)量，了解體質(zhì)量變化情況。

1.3.2 腎組織HE染色病理將腎組織修整為1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，放入5%多聚甲醛置于冰箱中固定24 h后，流水沖刷6 h。用乙醇依次從60%以10%為梯度逐步脫水至100%，再放入二甲苯中置換出乙醇。隨后放入恒溫箱浸沒在石蠟中待凝固。粗修蠟塊后將其固定在卡槽，以5 μm為度切成薄片，輕放于預熱好的攤片機上，隨后用載玻片將平整的蠟片撈起進行烤片，經(jīng)脫蠟、水化、蘇木精、伊紅染色后，再次用酒精、二甲苯脫水、透明后，用中性樹膠封片。采用光學放大倍400倍數(shù)進行觀察。見表1。

1.3.3 血象監(jiān)測經(jīng)腹主動脈取血后，將血漿置于抗凝管中，反復倒置數(shù)次，盡快運用全自動動物血液分析儀檢測紅細胞計數(shù)、血紅蛋白，全自動生化分析儀檢測血肌酐、血尿素氮。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測在反扣有冰的培養(yǎng)皿上取0.1 g腎組織迅速裝入0.8 ml裂解液及2粒瓷珠均需勻漿，頻率為20振蕩至管內(nèi)無明顯可見顆粒，再加入0.2 ml裂解液避免初次裝入過多致離心管爆裂。以4 ℃，13000 rmp轉(zhuǎn)速，離心5 min，剝離上層脂肪層，用移液器抽吸上清液至新的離心管。加入300 μl氯仿，振蕩靜置后，離心至三層水相，將上層無色水相抽吸分離RNA。再加入600 μl異丙醇混勻、靜置、離心，使RNA沉淀。最后洗滌RNA，再以DEPC水溶解RNA沉淀后，吹打均勻，用移液器取2 μl樣本，分光光度計(A260/280比值)測定其純度及濃度，并進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應，最后進行熒光定量檢測mRNA的相對表達量。

表1 引物序列(5’→3’)

1.3.5 免疫蛋白印跡WB檢測根據(jù)目的蛋白選取不同濃度的分離膠，注膠后加入超純水平衡液面，再以同法注入上層膠，并插入加樣孔梳。將膠板置入、電泳緩沖液置入電泳槽，依次加入Marker 5 μl及待測試樣本，先以50 V低電壓，后以90 V電壓電泳，待溴酚藍條帶接近膠底為止。用PVDF膜裁切成合適大小，置入樣品膠與濾紙間，排除氣泡后進行轉(zhuǎn)膜，而后用去離子水洗去膜上甲醛，用脫脂奶粉溶液封閉1～2 h。隨后進行一抗、二抗孵化，采用ECL發(fā)光液曝光，測定吸光度與內(nèi)參比值。

1.4 統(tǒng)計學方法選擇SPSS 20.0進行分析，按照均數(shù)±標準差的方式進行表達，通過單因素方差分析比較組間差異。P<0.05時，表明差異具有統(tǒng)計學意義；反之，如果P>0.05，就表明差異不具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況空白組和假手術組大鼠毛色光亮潔白，反應靈敏；模型組大鼠體型瘦小，反應遲鈍，毛色灰暗，灌胃時出現(xiàn)“豎毛”表現(xiàn)。桃核承氣湯組大鼠毛色略灰暗，反應稍遲鈍。

2.2 各組大鼠紅細胞計數(shù)、血紅蛋白比較模型組RBC及Hb數(shù)值較空白組明顯降低(P<0.05)；桃核承氣湯組、尿毒清組RBC及Hb數(shù)值較模型組升高(P<0.05)。桃核承氣湯組與尿毒清組無明顯差異(P>0.05)。結論：桃核承氣湯能使CRF大鼠的RBC及Hb含量升高。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠紅細胞計數(shù)的實驗結果比較

圖2 各組大鼠血紅蛋白的實驗結果比較

2.3 各組大鼠血肌酐、血尿素氮比較模型組血肌酐、尿素氮水平較空白組明顯升高(P<0.05)；桃核承氣湯組、尿毒清組血肌酐、尿素氮水平較模型組降低(P<0.05)。結論：桃核承氣湯能使CRF大鼠的血肌酐、血尿素含量降低。見圖3、圖4。

2.4 各組大鼠左腎組織HE病理空白組和假手術組腎臟形態(tài)、結構完整，腎小球、腎小管結構正常無紊亂；假手術組偶有炎癥細胞浸潤；模型組腎小球固縮，基膜增厚、間質(zhì)纖維增生、炎性細胞浸潤；桃核承氣湯組腎小球硬化程度較模型組、尿毒清組改善。見圖5。

圖3 各組大鼠血肌酐的實驗結果比較

圖4 各組大鼠血尿素氮的實驗結果比較

2.5 各組大鼠左腎組織Wnt1、β-catenin、Axin mRNA表達比較桃核承氣湯組Wnt1、β-catenin較模型組顯著降低(P<0.05)，Axin表達較模型組顯著升高(P<0.05)，且優(yōu)于尿毒清組。結論：桃核承氣湯使CRF大鼠Wnt1、β-catenin的mRNA表達顯著降低，Axin表達明顯升高。見表2。

表2 各組大鼠左腎組織Wnt1、β-catenin、Axin mRNA表達比較 (只，

圖5 各組大鼠左腎組織HE病理染色

2.6 各組大鼠左腎組織Wnt1、β-catenin、Axin蛋白表達比較桃核承氣湯組的Wnt1、β-catenin的蛋白表達較模型組明顯降低，而Axin表達較模型組顯著升高。結論：桃核承氣湯使CRF大鼠Wnt1、β-catenin的蛋白表達顯著降低，Axin表達明顯升高。

表3 各組大鼠左腎組織蛋白表達的2-ΔΔCT值比較 (只，

3 討論

慢性腎衰竭歸屬于中醫(yī)學“關格”范疇，其主要病機是正氣衰敗，濁毒、瘀血內(nèi)阻。在《傷寒論》中，對核桃承氣湯做出了較為詳細的記載，兩者發(fā)病機理、臨床表現(xiàn)、治療方式，都存在一些相似的地方。①發(fā)病機理都是正虛邪實。慢性腎衰竭的臟腑虧虛為本，濁毒和瘀血互結，形成邪實，桃核承氣湯的病機主要為瘀濁蘊結。從發(fā)病機理上來看，都存在瘀濁壅滯[3]。②從臨床癥狀上來看，這兩者存在很多相似的地方，桃核承氣湯的主癥除了較為常見的大便色黑、小便自利之外，還包括譫語煩躁、少腹急結等。而慢性腎衰竭的臨床癥狀主要包括：面色黧黑，肌膚甲錯；進入晚期后，出現(xiàn)少尿甚至無尿，和桃核承氣湯的硬滿不適、少腹急結非常相似；慢性腎衰竭由于代謝產(chǎn)物蓄積損傷神經(jīng)系統(tǒng)，早期可見煩躁、焦慮、不寧腿，進入晚期后，對外界刺激相對淡漠，和桃核承氣湯證候所出現(xiàn)的精神狀況類似，且兩者在治法上有共同性，在治療過程中，既可以采取泄?jié)嵬ǜ突钛龅氖侄?，達到治療的效果。結合諸多文獻及臨床實踐，故實驗擬通過桃核承氣湯，探討治療慢性腎衰竭可能作用機制[4,5]。

慢性腎功能不全時，機體為了維持正常代謝需要，健存腎單位負荷加重。本次試驗采用5/6腎切除模型亦是據(jù)健存腎單位學說，以殘腎模擬高灌注、高濾過、高代謝狀態(tài)符合本病發(fā)病機制且相對成熟，故予選用。大量研究表明，腎纖維化作為CRF的病理基礎與腎功能損害程度密切相關，貫穿慢性腎衰竭的全程。因此抗腎纖維化對延緩慢性腎衰竭進展起到較為重要的作用[6,7]。從相關研究結果來看，Wnt/β-catenin信號通路被證明有腎纖維化、急性腎損傷、慢性腎衰竭等多種疾病發(fā)展中起著重要作用[8,9]。對信號轉(zhuǎn)導進行分析，上游Wnt蛋白激活后，細胞內(nèi)β-catenin的不斷增加，致腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展，為此阻斷信號通路持續(xù)活化、抑制腎纖維化進程，對延緩慢性腎衰竭進展至關重要[10-12]。故在實驗過程中，選擇上游Wnt1、中游Axin和下游β-catenin。

綜上所述，通過實驗發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯組大鼠較模型組于一般情況、紅細胞計數(shù)、血尿素氮和血紅蛋白及分子生物學指標等均出現(xiàn)了明顯的改善現(xiàn)象。桃核承氣湯能通過抑制5/6腎切除大鼠模型中Wnt/β-catenin信號通路，下調(diào)Wnt1、β-catenin和上調(diào)Axin表達，減慢腎纖維化進展，從而延緩慢性腎衰竭的進程。