張喜奎 林祥發(fā) 馬 來 王旭麗 李靈輝 朱為坤

慢性腎衰竭是各種慢性腎臟病引起腎單位不可逆性破壞，以致殘存腎單位不足以充分排除代謝廢物及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的病理過程，從中醫(yī)學(xué)理論這一層面上來看，與“關(guān)格”非常相似。筆者臨床上運(yùn)用桃核承氣湯加減化裁治療慢性腎衰竭中取得確切療效，但分子生物學(xué)機(jī)理尚未闡明。在這樣的背景下，本研究將5/6腎切除大鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯刻液顺袣鉁泳徛阅I衰竭的機(jī)理。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料本研究，以125只大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，大鼠的體質(zhì)量波動(dòng)在180～200 g。按照隨機(jī)方式進(jìn)行分籠，提供標(biāo)準(zhǔn)飼料、超純水進(jìn)行喂養(yǎng)，1周后開始實(shí)驗(yàn)。主要藥物和試劑：①桃核承氣湯：本校附屬第二人民醫(yī)院開具飲片，經(jīng)過煎煮之后，形成濃縮液。②尿毒清顆粒。③注射用青霉素鈉：80萬(wàn)U/支，魯抗制藥生產(chǎn)。④Wnt1抗體Abcam Number:ab15251；Axin CST Number:3323；β-catenin抗體Number:51067-2-AP；β-actin抗體 Number:660091-1g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模將125只大鼠按照相同的方式飼養(yǎng)7 d后，按照隨機(jī)方式進(jìn)行分組。對(duì)模型組、尿毒清組、核桃承氣湯組的大鼠，將5/6腎切除，實(shí)施手術(shù)造模。根據(jù)體質(zhì)量估算麻醉劑量，禁食不禁水12 h，防止麻醉狀態(tài)誤吸；在腹腔部位注入水合氯醛，待麻醉藥發(fā)揮作用后，立即手術(shù)；首次手術(shù)沿著左腎肋脊角將左腎位置確定，備皮，利用碘伏進(jìn)行消毒處理，使用組織剪依序分離皮膚、肌肉，打開腹腔剪除所需腎組織用止血海綿按壓止血后逐層縫合；完成手術(shù)之后，連續(xù)3 d在腹腔注射青霉素，達(dá)到預(yù)防感染的效果；在手術(shù)之后的第7天，結(jié)扎并剪除右腎。假手術(shù)組分次剝離大鼠雙腎被膜。造模后經(jīng)眼底采血，觀察血尿素氮、血肌酐變化，若明顯升高，則說明造模成功[1，2]。

1.2.2 灌胃每日上午9:00將藥物放在EP管中，經(jīng)過恒溫水浴處理后進(jìn)行灌胃，桃核承氣湯組飲片煎煮后濃縮液進(jìn)行灌胃；對(duì)尿毒清組的大鼠，利用溫水溶解顆粒后的混懸液進(jìn)行灌胃；對(duì)剩下3組的大鼠，灌以等量生理鹽水，持續(xù)時(shí)間為56 d，每隔7 d稱重，如實(shí)記錄體質(zhì)量，了解體質(zhì)量變化情況，及時(shí)調(diào)整灌胃劑量。

1.2.3 標(biāo)本采集第57天，麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈采集血液檢測(cè)血肌酐、血尿素氮、血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)；取腎組織，50%腎組織進(jìn)行HE病理染色；剩下50%對(duì)半切開分置凍存管，用于Wb、PCR檢測(cè)。

1.3 觀察內(nèi)容

1.3.1 一般情況精神表現(xiàn)、大鼠毛發(fā)、靈敏度等，每隔7 d稱重，如實(shí)記錄體質(zhì)量，了解體質(zhì)量變化情況。

1.3.2 腎組織HE染色病理將腎組織修整為1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，放入5%多聚甲醛置于冰箱中固定24 h后，流水沖刷6 h。用乙醇依次從60%以10%為梯度逐步脫水至100%，再放入二甲苯中置換出乙醇。隨后放入恒溫箱浸沒在石蠟中待凝固。粗修蠟塊后將其固定在卡槽，以5 μm為度切成薄片，輕放于預(yù)熱好的攤片機(jī)上，隨后用載玻片將平整的蠟片撈起進(jìn)行烤片，經(jīng)脫蠟、水化、蘇木精、伊紅染色后，再次用酒精、二甲苯脫水、透明后，用中性樹膠封片。采用光學(xué)放大倍400倍數(shù)進(jìn)行觀察。見表1。

1.3.3 血象監(jiān)測(cè)經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后，將血漿置于抗凝管中，反復(fù)倒置數(shù)次，盡快運(yùn)用全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐、血尿素氮。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在反扣有冰的培養(yǎng)皿上取0.1 g腎組織迅速裝入0.8 ml裂解液及2粒瓷珠均需勻漿，頻率為20振蕩至管內(nèi)無(wú)明顯可見顆粒，再加入0.2 ml裂解液避免初次裝入過多致離心管爆裂。以4 ℃，13000 rmp轉(zhuǎn)速，離心5 min，剝離上層脂肪層，用移液器抽吸上清液至新的離心管。加入300 μl氯仿，振蕩?kù)o置后，離心至三層水相，將上層無(wú)色水相抽吸分離RNA。再加入600 μl異丙醇混勻、靜置、離心，使RNA沉淀。最后洗滌RNA，再以DEPC水溶解RNA沉淀后，吹打均勻，用移液器取2 μl樣本，分光光度計(jì)(A260/280比值)測(cè)定其純度及濃度，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)，最后進(jìn)行熒光定量檢測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列(5’→3’)

1.3.5 免疫蛋白印跡WB檢測(cè)根據(jù)目的蛋白選取不同濃度的分離膠，注膠后加入超純水平衡液面，再以同法注入上層膠，并插入加樣孔梳。將膠板置入、電泳緩沖液置入電泳槽，依次加入Marker 5 μl及待測(cè)試樣本，先以50 V低電壓，后以90 V電壓電泳，待溴酚藍(lán)條帶接近膠底為止。用PVDF膜裁切成合適大小，置入樣品膠與濾紙間，排除氣泡后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，而后用去離子水洗去膜上甲醛，用脫脂奶粉溶液封閉1～2 h。隨后進(jìn)行一抗、二抗孵化，采用ECL發(fā)光液曝光，測(cè)定吸光度與內(nèi)參比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選擇SPSS 20.0進(jìn)行分析，按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式進(jìn)行表達(dá)，通過單因素方差分析比較組間差異。P<0.05時(shí)，表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；反之，如果P>0.05，就表明差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況空白組和假手術(shù)組大鼠毛色光亮潔白，反應(yīng)靈敏；模型組大鼠體型瘦小，反應(yīng)遲鈍，毛色灰暗，灌胃時(shí)出現(xiàn)“豎毛”表現(xiàn)。桃核承氣湯組大鼠毛色略灰暗，反應(yīng)稍遲鈍。

2.2 各組大鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白比較模型組RBC及Hb數(shù)值較空白組明顯降低(P<0.05)；桃核承氣湯組、尿毒清組RBC及Hb數(shù)值較模型組升高(P<0.05)。桃核承氣湯組與尿毒清組無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)論：桃核承氣湯能使CRF大鼠的RBC及Hb含量升高。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

圖2 各組大鼠血紅蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.3 各組大鼠血肌酐、血尿素氮比較模型組血肌酐、尿素氮水平較空白組明顯升高(P<0.05)；桃核承氣湯組、尿毒清組血肌酐、尿素氮水平較模型組降低(P<0.05)。結(jié)論：桃核承氣湯能使CRF大鼠的血肌酐、血尿素含量降低。見圖3、圖4。

2.4 各組大鼠左腎組織HE病理空白組和假手術(shù)組腎臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常無(wú)紊亂；假手術(shù)組偶有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組腎小球固縮，基膜增厚、間質(zhì)纖維增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；桃核承氣湯組腎小球硬化程度較模型組、尿毒清組改善。見圖5。

圖3 各組大鼠血肌酐的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

圖4 各組大鼠血尿素氮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.5 各組大鼠左腎組織Wnt1、β-catenin、Axin mRNA表達(dá)比較桃核承氣湯組Wnt1、β-catenin較模型組顯著降低(P<0.05)，Axin表達(dá)較模型組顯著升高(P<0.05)，且優(yōu)于尿毒清組。結(jié)論：桃核承氣湯使CRF大鼠Wnt1、β-catenin的mRNA表達(dá)顯著降低，Axin表達(dá)明顯升高。見表2。

表2 各組大鼠左腎組織Wnt1、β-catenin、Axin mRNA表達(dá)比較 (只，

圖5 各組大鼠左腎組織HE病理染色

2.6 各組大鼠左腎組織Wnt1、β-catenin、Axin蛋白表達(dá)比較桃核承氣湯組的Wnt1、β-catenin的蛋白表達(dá)較模型組明顯降低，而Axin表達(dá)較模型組顯著升高。結(jié)論：桃核承氣湯使CRF大鼠Wnt1、β-catenin的蛋白表達(dá)顯著降低，Axin表達(dá)明顯升高。

表3 各組大鼠左腎組織蛋白表達(dá)的2-ΔΔCT值比較 (只，

3 討論

慢性腎衰竭歸屬于中醫(yī)學(xué)“關(guān)格”范疇，其主要病機(jī)是正氣衰敗，濁毒、瘀血內(nèi)阻。在《傷寒論》中，對(duì)核桃承氣湯做出了較為詳細(xì)的記載，兩者發(fā)病機(jī)理、臨床表現(xiàn)、治療方式，都存在一些相似的地方。①發(fā)病機(jī)理都是正虛邪實(shí)。慢性腎衰竭的臟腑虧虛為本，濁毒和瘀血互結(jié)，形成邪實(shí)，桃核承氣湯的病機(jī)主要為瘀濁蘊(yùn)結(jié)。從發(fā)病機(jī)理上來看，都存在瘀濁壅滯[3]。②從臨床癥狀上來看，這兩者存在很多相似的地方，桃核承氣湯的主癥除了較為常見的大便色黑、小便自利之外，還包括譫語(yǔ)煩躁、少腹急結(jié)等。而慢性腎衰竭的臨床癥狀主要包括：面色黧黑，肌膚甲錯(cuò)；進(jìn)入晚期后，出現(xiàn)少尿甚至無(wú)尿，和桃核承氣湯的硬滿不適、少腹急結(jié)非常相似；慢性腎衰竭由于代謝產(chǎn)物蓄積損傷神經(jīng)系統(tǒng)，早期可見煩躁、焦慮、不寧腿，進(jìn)入晚期后，對(duì)外界刺激相對(duì)淡漠，和桃核承氣湯證候所出現(xiàn)的精神狀況類似，且兩者在治法上有共同性，在治療過程中，既可以采取泄?jié)嵬ǜ突钛龅氖侄?，達(dá)到治療的效果。結(jié)合諸多文獻(xiàn)及臨床實(shí)踐，故實(shí)驗(yàn)擬通過桃核承氣湯，探討治療慢性腎衰竭可能作用機(jī)制[4,5]。

慢性腎功能不全時(shí)，機(jī)體為了維持正常代謝需要，健存腎單位負(fù)荷加重。本次試驗(yàn)采用5/6腎切除模型亦是據(jù)健存腎單位學(xué)說，以殘腎模擬高灌注、高濾過、高代謝狀態(tài)符合本病發(fā)病機(jī)制且相對(duì)成熟，故予選用。大量研究表明，腎纖維化作為CRF的病理基礎(chǔ)與腎功能損害程度密切相關(guān)，貫穿慢性腎衰竭的全程。因此抗腎纖維化對(duì)延緩慢性腎衰竭進(jìn)展起到較為重要的作用[6,7]。從相關(guān)研究結(jié)果來看，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被證明有腎纖維化、急性腎損傷、慢性腎衰竭等多種疾病發(fā)展中起著重要作用[8,9]。對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行分析，上游Wnt蛋白激活后，細(xì)胞內(nèi)β-catenin的不斷增加，致腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展，為此阻斷信號(hào)通路持續(xù)活化、抑制腎纖維化進(jìn)程，對(duì)延緩慢性腎衰竭進(jìn)展至關(guān)重要[10-12]。故在實(shí)驗(yàn)過程中，選擇上游Wnt1、中游Axin和下游β-catenin。

綜上所述，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯組大鼠較模型組于一般情況、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血尿素氮和血紅蛋白及分子生物學(xué)指標(biāo)等均出現(xiàn)了明顯的改善現(xiàn)象。桃核承氣湯能通過抑制5/6腎切除大鼠模型中Wnt/β-catenin信號(hào)通路，下調(diào)Wnt1、β-catenin和上調(diào)Axin表達(dá)，減慢腎纖維化進(jìn)展，從而延緩慢性腎衰竭的進(jìn)程。