亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        常量法和微量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        2021-04-06 01:08:58趙玉榮陳翠霞張黎民李幸凡王文鑫
        關(guān)鍵詞:酶標(biāo)儀常量光度計(jì)

        趙玉榮,陳翠霞,張黎民,李幸凡,王文鑫

        (中國石油大學(xué)(華東) 化學(xué)工程學(xué)院,山東 青島 266580)

        實(shí)驗(yàn)教學(xué)在化學(xué)和生物學(xué)科教學(xué)中承擔(dān)著不可替代的作用,是學(xué)生從事科研工作的基礎(chǔ)。綜合性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)有利于將傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)“以教師為中心”的模式轉(zhuǎn)變?yōu)椤耙詫W(xué)生為中心”的模式。綜合實(shí)驗(yàn)的開展有助于提高學(xué)生查閱文獻(xiàn)和歸納總結(jié)的能力,是提高學(xué)生創(chuàng)新能力的重要途徑之一[1-2]。蛋白質(zhì)是組成人體細(xì)胞的基本成分,機(jī)體的重要生命活動(dòng)都需要蛋白質(zhì)的參與,它是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者[3-4]。蛋白質(zhì)測(cè)定是指通過物理或化學(xué)方法對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定,是生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中最常用的基本分析方法之一。測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法包括凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法(Bradford 法)等。其中,Bradford 法因具有靈敏度高、測(cè)定快速簡便和干擾物少等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注[5-11]。基于Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)是生物化學(xué)本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要組成部分,但實(shí)驗(yàn)一般基于一種方法進(jìn)行,往往導(dǎo)致兩方面問題:一方面,學(xué)生不能很好地掌握常量法和微量法的區(qū)別;另一方面,單一儀器的應(yīng)用很難解決多分組實(shí)驗(yàn)擁擠等資源緊張的問題。基于此,本文設(shè)計(jì)了利用紫外分光光度計(jì)(常量法)和多功能酶標(biāo)儀(微量法)同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定的綜合性實(shí)驗(yàn)。這種方法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合時(shí)產(chǎn)生復(fù)合物導(dǎo)致染料的顏色發(fā)生變化的原理設(shè)計(jì)的,如圖1 所示。

        圖1 Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理示意圖

        染料考馬斯亮蘭G-250(二甲花青亮藍(lán))的磷酸溶液呈棕紅色,最大吸收峰在465 nm,在酸性條件下其可與蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香氨基酸結(jié)合,形成復(fù)合物時(shí),溶液呈現(xiàn)淺藍(lán)色,導(dǎo)致染料的最大吸收峰的位置變?yōu)?95 nm。在一定范圍內(nèi),595 nm 處測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系,因此可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[5-11]。

        紫外分光光度計(jì)[12]和多功能酶標(biāo)儀[13-15]都是測(cè)量吸光度的儀器,但原理存在一定差異。紫外分光光度計(jì)在測(cè)量過程中可以通過設(shè)置特定波長的單色光直接作用于樣品(見圖2(a)),進(jìn)而測(cè)得其在特定波長的吸光度;而多功能酶標(biāo)儀則首先通過一定波段的濾光片獲得目標(biāo)波段,經(jīng)過光路改變器改變?nèi)肷涔獾姆较?,從頂部垂直照射在樣品上(見圖2(b)),進(jìn)而測(cè)得樣品的吸光度。另外,兩種測(cè)量方法使用的樣品池不同,紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度一般用常量石英比色皿樣品池,而多功能酶標(biāo)儀則使用微量孔板(如96 孔板或384 孔板),使用移液槍將樣品轉(zhuǎn)移到孔板中。由于測(cè)量樣品的體積不同,上述兩種方法分別被稱為常量法和微量法。相比于紫外分光光度計(jì),多功能酶標(biāo)儀根據(jù)用途的特殊性限定了范圍和設(shè)置界面,快速且簡便。同時(shí),多功能酶標(biāo)儀可同時(shí)在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)幾十組樣品,工作效率大大提高,這可保證不同樣品在相同靜置時(shí)間和儀器狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)定。

        圖2 紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀的工作原理

        本實(shí)驗(yàn)首先配制了不同濃度的蛋白溶液并進(jìn)行了吸光度測(cè)定,在此基礎(chǔ)上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,隨后對(duì)未知樣品進(jìn)行測(cè)定,將其吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程即可求得未知樣品中的蛋白含量。在此基礎(chǔ)上,考察了SDS 對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的影響并分析了原因。實(shí)驗(yàn)中,將學(xué)生分為兩組,在測(cè)量蛋白質(zhì)含量和SDS 干擾時(shí)僅選擇一種儀器進(jìn)行試驗(yàn)即可。這樣,每組學(xué)生均可使用兩種儀器進(jìn)行吸光度測(cè)定,有助于拓寬學(xué)生的知識(shí)面。

        本實(shí)驗(yàn)同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀開展實(shí)驗(yàn),一方面,有助于學(xué)生同時(shí)掌握常量法和微量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,了解上述兩種儀器工作原理、操作流程和使用方法,為今后從事科研工作奠定基礎(chǔ)。另一方面,由于多功能酶標(biāo)儀和紫外分光光度計(jì)的配合使用,將大大提高多分組實(shí)驗(yàn)的測(cè)量效率,同時(shí)有助于學(xué)生學(xué)習(xí)和使用移液槍等常用工具,非常適合作為綜合性實(shí)驗(yàn)向本科生開設(shè)。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

        (1)掌握考馬斯亮藍(lán)染色法定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理與方法。

        (2)熟練紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀的使用和操作方法。

        (3)了解紫外分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀測(cè)量方法的異同點(diǎn)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與實(shí)驗(yàn)儀器

        實(shí)驗(yàn)藥品:牛血清蛋白BSA(純度98%,Sigma);考馬斯亮藍(lán)G-250(99.9%,Sigma);乙醇(99%,上海國藥);85%的磷酸溶液(上海國藥);SDS(98%,Sigma)。

        實(shí)驗(yàn)儀器:紫外光分光光度計(jì)/多功能酶標(biāo)儀;漩渦混合器;容量瓶;量筒;電子分析天平;EP 管/96孔板;試管架;移液槍;一次性槍頭。

        1.3 溶液配制

        (1)配制1 mg/mL BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:稱量BSA 100 mg,用超純水溶解并稀釋至100 mL。

        (2)配制0.01%(w/w)的考馬斯亮蘭G-250 染料溶液:稱量100 mg 的考馬斯亮蘭,先溶于50 mL 95%的乙醇,再加入85%的磷酸溶液120 mL,用超純水稀釋至1 000 mL。

        (3)不同濃度的樣品液:取1 mg/mL 的BSA 母液,用超純水稀釋到所需濃度。

        (4)配制SDS 100 μg/mL 的SDS 溶液:稱量SDS粉末10 mg,加入超純水溶解并稀釋至100 mL。

        表1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度-標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制所需樣品的組分

        1.4 實(shí)驗(yàn)方法

        1)常量法和微量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

        (1)取9 支試管,按表1 分別編號(hào)后依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白(或未知蛋白)、去離子水和考馬斯亮蘭染料溶液,加完后立即在漩渦混合器上混合。

        (2)上述混合后的樣品室溫下靜置3 min,兩組同學(xué)分別使用紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在595 nm 處的吸光度A595(使用紫外分光光度計(jì)時(shí),選擇石英比色皿為樣品池,以第一管為空白,加入一定體積的溶液;使用酶標(biāo)儀時(shí),取96 孔板,依次按照編號(hào)用移液槍移取樣品200 μL 至對(duì)應(yīng)孔中,每個(gè)樣品平行測(cè)定5 組求平均值)。

        (3)分別以蛋白濃度和A595為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)作圖并進(jìn)行直線擬合,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(Y=aX+b)。

        (4)測(cè)量未知蛋白樣品的吸光度A595,將測(cè)量值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,即可求得未知樣品中的蛋白含量。

        2)SDS 干擾試驗(yàn)。

        (1)取7 支試管,分別編號(hào)后按表2 劑量依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白、SDS、超純水和考馬斯亮蘭染料溶液。每支試管加完后,立即在漩渦混合器上混合。

        (2)將上述溶液混合后靜置3 min,使用紫外分光光度計(jì)或多功能酶標(biāo)儀(本文僅使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量),測(cè)量595 nm 處吸光度A595。分別以A595和SDS 濃度為縱、橫坐標(biāo)作圖,繪制SDS 干擾試驗(yàn)的曲線,在此基礎(chǔ)上分析其干擾機(jī)理。

        表2 測(cè)定SDS 干擾實(shí)驗(yàn)曲線的樣品編號(hào)及不同成分的含量

        圖3 通過常量法(紫外分光光度計(jì))測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2 結(jié)果與討論

        2.1 常量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

        首先利用常量法測(cè)定了蛋白質(zhì)含量,通過紫外分光光度計(jì)測(cè)量了表1 中不同濃度的BSA 溶液與染料作用后在595 nm 處的吸光度值,作為縱坐標(biāo),BSA 濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行擬合,如圖3 所示。通過擬合曲線得到相關(guān)系數(shù)R2為0.996 72,相關(guān)性好,可用于進(jìn)一步標(biāo)定和計(jì)算未知蛋白質(zhì)的濃度。此時(shí),本文進(jìn)一步對(duì)未知蛋白1 和2 進(jìn)行測(cè)定,其在595 nm 處的吸光度值分別為0.543 和0.760,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出未知蛋白濃度為12.62 μg/mL 和18.63 μg/mL。

        2.2 微量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

        隨后利用微量法測(cè)定了蛋白質(zhì)的含量,通過酶標(biāo)儀同時(shí)測(cè)量了表1 不同濃度的BSA 溶液與染料作用后在595 nm 處的吸光度值(每組樣品平行測(cè)定5 個(gè)孔求平均值),以其為縱坐標(biāo),BSA 濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行作圖,繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行擬合,如圖4 所示。通過擬合曲線得到相關(guān)系數(shù)R2為0.998 08,相關(guān)性好,可用于進(jìn)一步標(biāo)定和計(jì)算未知蛋白質(zhì)的濃度。此時(shí),進(jìn)一步對(duì)未知蛋白 1 和 2 進(jìn)行了吸光度測(cè)定,其在595 nm 處的吸光度值分別為0.323 和0.430,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出未知蛋白濃度為 14.70 μg/mL 和20.15 μg/mL,與通過常量法測(cè)得的數(shù)據(jù)相比,更接近未知蛋白的實(shí)際濃度15 μg/mL 和20 μg/mL,這主要是由于多功能酶標(biāo)儀在測(cè)量過程中使用孔板,每次可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品,每個(gè)樣品可平行測(cè)定多組,保證了同樣的儀器狀態(tài)和樣品放置時(shí)間,一定程度上提高了測(cè)量的準(zhǔn)確度,且大大提升了測(cè)量效率。但由于孔板的利用,也會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)增加。

        上述結(jié)果表明,盡管常量法和微量法均可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定,但兩種方法的測(cè)量原理、所需樣品量、測(cè)量效率以及測(cè)量準(zhǔn)確度均存在差異,研究中需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。當(dāng)需要測(cè)量的樣品數(shù)量多,體積小時(shí),應(yīng)該選擇多功能酶標(biāo)儀利用微量法進(jìn)行測(cè)定;而當(dāng)樣品數(shù)量較少,樣品體積較多時(shí),可選擇紫外分光光度計(jì)用常量法進(jìn)行測(cè)定。如果樣品數(shù)量和體積居中,可以依據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)量準(zhǔn)確度和實(shí)驗(yàn)成本等因素的要求選擇其中一種方法進(jìn)行測(cè)試或選取兩種方法平行驗(yàn)證。

        圖4 通過微量法(酶標(biāo)儀)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.3 SDS 對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的干擾

        盡管Bradford 法具有很多優(yōu)點(diǎn),但也存在一定缺點(diǎn),如一些物質(zhì)存在會(huì)干擾測(cè)量的準(zhǔn)確性,這些物質(zhì)主要包括去污劑、Triton X-100 和SDS 等,本部分考察了SDS 對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的干擾。利用常量法對(duì)表2的樣品進(jìn)行了測(cè)定,分別以吸光度和SDS 濃度為縱、橫坐標(biāo)進(jìn)行作圖,結(jié)果如圖5 所示。

        圖5 SDS 對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的干擾曲線

        從上圖可以看出,SDS 可顯著干擾蛋白質(zhì)含量測(cè)定,測(cè)量結(jié)果表明:吸光度隨SDS 濃度的增加出現(xiàn)了先減小后增大的現(xiàn)象,造成上述結(jié)果的主要原因是,SDS 可以有效斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu),同時(shí),當(dāng)SDS 與蛋白質(zhì)結(jié)合后會(huì)形成蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物,導(dǎo)致蛋白質(zhì)帶上大量的負(fù)電荷,阻礙染料與堿性氨基酸和芳香族氨基酸的有效結(jié)合,導(dǎo)致吸光度降低。而當(dāng)SDS 加入蛋白質(zhì)溶液后,導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,又會(huì)使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)更加伸展,使原來一些包裹在結(jié)構(gòu)中未與染料結(jié)合的堿性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出來,促進(jìn)染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合,因此導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果出現(xiàn)先增加后減小的情況。

        3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式與內(nèi)容拓展

        本實(shí)驗(yàn)將常量法和微量法結(jié)合用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,分析了兩種方法的異同點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上,考察了SDS 對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的干擾,發(fā)現(xiàn)隨著SDS 含量的增加,蛋白濃度出現(xiàn)了先增加后減小的情況,這主要是由于靜電作用和蛋白質(zhì)變性兩方面的因素造成。通過本實(shí)驗(yàn)的開展,可實(shí)現(xiàn)如下目標(biāo):

        (1)學(xué)生可掌握Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法和原理,即染料單體與復(fù)合物顏色不同,分別在465 nm 和595 nm 處存在吸收。

        (2)學(xué)生可掌握紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀的使用方法和原理,了解常量法和微量法測(cè)定的異同點(diǎn)。同時(shí)紫外分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀的綜合運(yùn)用可提高測(cè)量效率,解決本科實(shí)驗(yàn)室人數(shù)多、大型實(shí)驗(yàn)儀器相對(duì)較少的問題。

        (3)處理數(shù)據(jù)的過程中,學(xué)生可掌握利用Origin處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的方法,提高學(xué)生的數(shù)據(jù)處理能力。而針對(duì)測(cè)量結(jié)果,特別是SDS 干擾實(shí)驗(yàn),有助于學(xué)生理解氨基酸的電性和蛋白質(zhì)變性等生物化學(xué)中的重要概念和知識(shí)點(diǎn),提高學(xué)生分析問題和解決問題的能力。

        (4)由于不同分組之間需要協(xié)調(diào)紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀的使用,該實(shí)驗(yàn)需要學(xué)生協(xié)作完成,這可有效提高學(xué)生的合作和溝通能力,為今后的科研工作奠定良好的基礎(chǔ)。

        猜你喜歡
        酶標(biāo)儀常量光度計(jì)
        科學(xué)照亮世界
        ——卡文迪什測(cè)定萬有引力常量
        原子吸收分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)與管理
        云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:31:26
        關(guān)于酶標(biāo)儀計(jì)量檢測(cè)的探討
        免標(biāo)記法快速檢測(cè)啶蟲脒的研究
        多功能酶標(biāo)儀工作原理、選購指南
        原子吸收分光光度計(jì)火焰發(fā)射法測(cè)定鈉的含量
        低氧低分壓環(huán)境下泡塑吸附火焰原子吸收光譜法測(cè)定常量金
        西藏科技(2015年1期)2015-09-26 12:09:20
        環(huán)保監(jiān)測(cè)中紫外可見光分光光度計(jì)的應(yīng)用探析
        河南科技(2014年4期)2014-02-27 14:07:26
        紅外分光光度計(jì)檢定不確定度評(píng)定
        論常量函數(shù)的充分必要條件
        亚洲a人片在线观看网址| 久久精品无码av| 国产无套护士在线观看| 日本视频一区二区三区免费观看 | 亚洲日本国产精品久久| 国产99久久久国产精品免费看| 久久精品国产日本波多麻结衣| 国产熟女av一区二区三区四季| 精华国产一区二区三区| 国产免费一区二区三区免费视频 | 无遮挡边摸边吃奶边做视频免费 | 色多多a级毛片免费看| 国产精品九九热| 国产麻豆极品高清另类| 精人妻无码一区二区三区| 特黄a级毛片免费视频| 青草青草伊人精品视频| 少妇精品揄拍高潮少妇桃花岛| 狂野欧美性猛xxxx乱大交| 中文字幕美人妻亅u乚一596| 99热高清亚洲无码| 性色av色香蕉一区二区蜜桃| 亚洲精品夜夜夜妓女网| 精品伊人久久香线蕉| 日本精品熟妇一区二区三区| 精品国产一区二区三区色搞| 无码精品a∨在线观看| 国产熟女精品一区二区三区| 国家一级内射高清视频| 狼狼综合久久久久综合网| 日韩一欧美内射在线观看| 精品国产亚洲av成人一区| 日本一二三区在线观看视频| 亚洲精品第一国产综合亚av| 国产成人av在线影院无毒| 精品人妻一区二区三区狼人| 亚洲欧美日韩精品久久| 最新国产乱视频伦在线| 偷拍与自偷拍亚洲精品| 一本久道综合色婷婷五月| 免费人成年小说在线观看|