劉莎莎，孫國強(qiáng)，吳利榮

1 湖北省婦幼保健院，武漢430070；2 武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院

妊娠期高血壓（PIH）一般發(fā)生于妊娠20 周后，以高血壓、蛋白尿、水腫為主要臨床癥狀并伴全身性多臟器損害［1-2］。PIH 病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是導(dǎo)致孕婦和胎兒死亡的主要原因［3-4］。胎兒正常生長發(fā)育需要胎盤建立豐富的血管網(wǎng)絡(luò)和滋養(yǎng)層細(xì)胞。在PIH 過程中，胎盤組織所分泌的生長因子水平變化對胎盤形成及胎兒發(fā)育過程起重要作用［5-6］。血管內(nèi)皮生長因子受體1（sFlt-1）、胎盤生長因子（PLGF）可由胎盤分泌，是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族成員，參與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和分化、胎盤絨毛膜血管形成及胚胎發(fā)育過程，二者表達(dá)異常與PIH 發(fā)病關(guān)系密切［7-8］。中藥丹參能破宿血、生新血、安生胎、落死胎、止崩中帶下，為調(diào)經(jīng)脈之神品，其提取物丹參素具有降低血壓、軟化血管、改善血液黏度等藥理作用［9-10］。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)，丹參對PIH 有較好的治療效果［11-12］，然而具有降壓和軟化血管作用的丹參素對PIH 過程中PLGF、sFlt-1 表達(dá)及血管功能的影響，目前報道較少。2018 年1 月—2020 年2月，本研究觀察了丹參素對大鼠PIH模型的治療作用，并從PLGF、sFlt-1表達(dá)及血管功能方面探討相關(guān)治療機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 健康雌性SPF 清潔級SD 大鼠（6～7 周齡，體質(zhì)量200～220 g）購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心［SCXK（粵）2018-0002］，飼養(yǎng)于本院動物飼養(yǎng)中心。飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食，溫度25 ℃，相對濕度50%。本研究經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)，批號為IACUC-01（20160917）。實驗嚴(yán)格遵循3R原則。丹參素注射液（規(guī)格10 mg）購自北京索萊寶科技有限公司。一氧化氮合酶（eNOs）抑制劑亞硝基左旋精氛酸甲酯（規(guī)格5 g）購自南京奧多福生物科技有限公司。HE 染色試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。24 h尿蛋白試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。一氧化氮（NO）試劑盒購自上海研生實業(yè)有限公司。sFlt-1抗體、PLGF抗體、磷酸化eNOs（p-eNOs）抗體購自美國Abcam 公司。細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒購自上海三抒生物科技有限公司。BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶購自美國Pierce 公司。手動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購自德國Leica 公司。光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司。蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad 公司。凝膠成像儀購自Miulab公司。

1.2 PIH 模型建立、分組及給藥方法 參照肖麗等［12］的方法，將雌雄大鼠混養(yǎng)，次日檢查雌性大鼠陰道精子，挑選出有精子的雌性大鼠70 只單獨飼養(yǎng)，并記為妊娠第1 天，于妊娠第14天隨機(jī)從70 只孕鼠中選出60 只經(jīng)靜脈注射亞硝基左旋精氛酸甲酯（7 mg/kg、1次/天、連續(xù)4 d）建立PIH模型，用小動物血壓計檢測大鼠尾動脈收縮壓，若血壓高于110 mmHg視為造模成功。將造模成功的50 只孕鼠隨機(jī)分為PIH 組，丹參素低、中、高劑量組以及陽性對照組，每組10 只。妊娠第18天，丹參素低、中、高劑量組和陽性對照組分別經(jīng)尾部肌肉注射5、10、20 mg/kg的丹參素和100 mg/kg 的硫酸鎂［12-13］，1 次/天，共給藥3 d；PIH 組只造模不給予其他藥物。10只未造模的孕鼠為正常組，給予尾靜脈注射生理鹽水，1次/天，共3 d。

1.3 血壓、尿蛋白監(jiān)測 于妊娠第20 天末次給藥6 h 后收集大鼠24 h 尿液，取1 mL 用考馬斯亮藍(lán)法檢測24 h 尿蛋白量。于妊娠第21 天采用小動物血壓測量計，借助生物信號采樣分析系統(tǒng)，通過套尾法測定大鼠尾動脈收縮壓。

1.4 胎鼠體質(zhì)量、體長及畸形率、死亡率檢測 各組大鼠在進(jìn)行完“1.3”實驗后，立即行剖宮術(shù)，小心取出胎鼠，并測定各胎鼠身長、體質(zhì)量，統(tǒng)計畸形率、死亡率。

1.5 胎盤質(zhì)量及胎盤損傷情況觀察 胎盤稱重后，取0.5 g 胎盤組織剪碎，用組織研磨器勻漿，離心后取上清液，置于－20 ℃冰箱中保存，剩余胎盤組織于4% 多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)透明、浸蠟、包埋，切成厚度為5 μm 的切片。行HE 染色，顯微鏡下觀察胎盤組織絨毛形態(tài)變化。

1.6 血清NO 及胎盤組織中sFlt-1、PLGF、p-eNOs蛋白檢測 各組大鼠用3% 戊巴比妥鈉麻醉，取腹主動脈血5 mL，靜置、離心后取上清液，按ELISA 試劑盒說明書檢測血清NO。取組織勻漿液，于4 ℃冰箱中解凍后，用蛋白提取試劑盒及BCA 試劑盒提取蛋白并檢測蛋白總濃度，取50 μg 蛋白上樣，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h 后，加入一抗（sFlt-1、PLGF、p-eNOs 為1∶1 000，內(nèi)參β-actin 為1∶2 000），室溫孵育過夜后，加入HRP 羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h 后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，用凝膠成像儀觀察條帶并拍照，Image J軟件分析各組蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較行LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓及尿蛋白量比較 造模各組大鼠血壓、24 h 尿蛋白量均高于正常組（P均＜0.05）；PIH 組、陽性對照組及丹參素低、中、高劑量組的血壓、24 h尿蛋白量依次降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血壓、24 h尿蛋白量比較（）

表1 各組大鼠血壓、24 h尿蛋白量比較（）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與PIH 組相比，bP＜0.05；與陽性對照組相比，cP＜0.05；與丹參素低劑量組相比，dP＜0.05；與丹參素中劑量組相比，eP＜0.05。

24 h尿蛋白量（mg）271.33 ± 6.71abcde 381.12 ± 16.82abcd 492.95 ± 16.99ab 498.97 ± 17.08ab 678.29 ± 18.64a 163.17 ± 16.29組別丹參素高劑量組丹參素中劑量組丹參素低劑量組陽性對照組PIH組正常組n 10 10 10 10 10 10血壓（mmHg）125.92 ± 10.19abcde 140.69 ± 11.21abcd 156.62 ± 11.79ab 156.59 ± 11.21ab 179.58 ± 13.25a 102.95 ± 10.99

2.2 各組胎鼠體質(zhì)量、體長及畸形率、死亡率、胎盤質(zhì)量比較 造模各組大鼠胎盤質(zhì)量、胎鼠體質(zhì)量、體長低于正常組，畸形率、死亡率高于正常組（P均＜0.05）；PIH 組、陽性對照組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組大鼠胎盤質(zhì)量、胎鼠體質(zhì)量、體長依次增高，胎鼠畸形率、死亡率依次降低（P均＜0.05）；丹參素各組大鼠胎盤質(zhì)量、胎鼠體質(zhì)量、體長及畸形率、死亡率兩兩相比，P均＜0.05。見表2。

2.3 各組胎盤組織損傷情況比較 正常組大鼠胎盤組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，未見明顯損傷。與正常組相比，PIH 組大鼠胎盤組織絨毛數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)萎縮、結(jié)構(gòu)不清。與PIH 組相比，丹參素低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠胎盤組織絨毛數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)萎縮等病理損傷程度減輕。見圖1。

表2 各組大鼠胎盤質(zhì)量、新生鼠體質(zhì)量、體長、畸形率、死亡率比較（）

表2 各組大鼠胎盤質(zhì)量、新生鼠體質(zhì)量、體長、畸形率、死亡率比較（）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與PIH組相比，bP＜0.05；與陽性對照組相比，cP＜0.05；與丹參素低劑量組相比，dP＜0.05；與丹參素中劑量組相比，eP＜0.05。

死亡率（%）組別n 胎盤質(zhì)量（g）新生鼠體質(zhì)量（g）新生鼠體長（cm）畸形率（%）3.53 ± 0.11abcde 7.01 ± 0.10abcd 13.05 ± 0.11ab 13.61 ± 0.12ab 15.09 ± 0.13a 0丹參素高劑量組丹參素中劑量組丹參素低劑量組陽性對照組PIH組正常組10 10 10 10 10 10 3.22 ± 0.04abcde 2.61 ± 0.03abcd 1.83 ± 0.02ab 1.82 ± 0.03ab 1.08 ± 0.02a 3.95 ± 0.04 5.03 ± 0.11abcde 4.61 ± 0.10abcd 3.95 ± 0.09ab 3.91 ± 0.09ab 3.29 ± 0.08a 5.57 ± 0.11 4.33 ± 0.11abcde 3.99 ± 0.10abcd 3.45 ± 0.09ab 3.41 ± 0.09ab 3.09 ± 0.03a 4.67 ± 0.04 6.53 ± 0.11abcde 19.11 ± 0.27abcd 25.59 ± 0.28ab 26.01 ± 0.29ab 30.19 ± 0.31a 0

2.4 各組大鼠血清NO 水平及胎盤組織sFlt-1、PLGF、eNOS 蛋白表達(dá)比較 造模各組大鼠血清NO水平、胎盤組織PLGF 和p-eNOS 蛋白表達(dá)低于正常組，sFlt-1蛋白表達(dá)高于正常組（P均＜0.05）；PIH組、陽性對照組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組大鼠血清NO 水平、胎盤組織PLGF 和p-eNOS 蛋白表達(dá)依次升高，sFlt-1 蛋白表達(dá)依次降低（P均＜0.05）；丹參素各組NO 水平及sFlt-1、PLGF、eNOS 蛋白表達(dá)兩兩相比，P均＜0.05。見表3、圖2。

3 討論

PIH 主要發(fā)生在妊娠中晚期，主要臨床癥狀為高血壓、蛋白尿，可導(dǎo)致死胎、死產(chǎn)、胎盤早剝及母兒死亡等嚴(yán)重產(chǎn)科并發(fā)癥［14］。靜脈注射亞硝基左旋精氛酸甲酯可建立大鼠PIH 模型，該造模方法簡單、成功率高、大鼠死亡率低［15］。本研究用上述方法建立PIH 模型后發(fā)現(xiàn)，大鼠血壓、尿蛋白量升高的同時，胎鼠體質(zhì)量、身長降低，死胎率、胎鼠畸形率升高，伴隨著胎盤質(zhì)量降低及胎盤組織絨毛數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)萎縮、結(jié)構(gòu)不清等病理損傷加重，與人PIH 臨床癥狀及并發(fā)癥相似，表明造模成功。

圖1 各組大鼠胎盤組織HE染色觀察結(jié)果

表3 各組大鼠血清NO水平及胎盤組織中sFlt-1、PLGF、p-eNOS蛋白表達(dá)比較（）

表3 各組大鼠血清NO水平及胎盤組織中sFlt-1、PLGF、p-eNOS蛋白表達(dá)比較（）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與PIH組相比，bP＜0.05；與陽性對照組相比，cP＜0.05；與丹參素低劑量組相比，dP＜0.05；與丹參素中劑量組相比，eP＜0.05。

p-eNOS 0.94 ± 0.12abcde 0.75 ± 0.14abcd 0.56 ± 0.12abc 0.51 ± 0.13ab 0.25 ± 0.14a 1.24 ± 0.12組別丹參素高劑量組丹參素中劑量組丹參素低劑量組陽性對照組PIH組正常組n 10 10 10 10 10 10 NO（μmol/mL）30.39 ± 2.79abcde 22.42 ± 2.82abcd 14.68 ± 1.92ab 14.38 ± 1.33ab 6.92 ± 0.96a 30.86 ± 3.09 sFlt-1 0.54 ± 0.13abcde 0.73 ± 0.14abcd 1.01 ± 0.15ab 1.02 ± 0.16ab 1.41 ± 0.17a 0.24 ± 0.13 PLGF 1.06 ± 0.12abcde 0.74 ± 0.10abcd 0.47 ± 0.05abc 0.49 ± 0.06ab 0.16 ± 0.05a 1.39 ± 0.15

圖2 大鼠胎盤組織中sFlt-1、PLGF、p-eNOS蛋白表達(dá)情況

近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮受損、血管活性物質(zhì)失衡導(dǎo)致的血管功能紊亂是PIH 發(fā)病的重要因素［16］。eNOs 及NO 在妊娠血管內(nèi)皮分化、修復(fù)及血管新生中扮演重要角色。劉懷昌等［17］發(fā)現(xiàn)妊娠時胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞中eNOs增多，在促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞分化及增殖的同時，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放合成大量NO來擴(kuò)張血管，調(diào)節(jié)血流速度來降低血壓，維持孕婦循環(huán)系統(tǒng)功能正常，從而使孕婦更好適應(yīng)妊娠全過程。這表明eNOs、NO 在妊娠血壓及孕婦血液循環(huán)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)中扮演重要角色。另外，NO減少也與PIH 及不良妊娠結(jié)局關(guān)系密切。周瑞霞等［18］發(fā)現(xiàn)，血清NO 越高，血管內(nèi)皮素水平越低，PIH 不良妊娠結(jié)局發(fā)生率越小。本研究發(fā)現(xiàn)，PIH 組大鼠血壓升高的同時，血清NO 水平及胎盤組織p-eNOs 表達(dá)也隨之降低，提示PIH 大鼠胎盤組織eNOs 活性降低，NO合成減少可能與胎盤血管功能受損關(guān)系密切。

大量研究證實，胎盤組織PLGF、sFlt-1表達(dá)異常也可引起血管生成及功能障礙，導(dǎo)致胎盤缺氧，參與PIH不良妊娠結(jié)局的發(fā)生［7］。JIANG等［19］發(fā)現(xiàn)，sFlt-1在胎盤產(chǎn)生后，可抑制VEGF 信號傳遞及生物學(xué)活性，引起血管生成障礙，并干擾胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和分化，引起不良妊娠結(jié)局。王芳［20］研究認(rèn)為，PIH過程中胎盤組織sFlt-1 異常升高引起血管生成失衡，是造成胎盤滋養(yǎng)層侵襲不足、子宮螺旋動脈重鑄不良、胎盤缺氧的重要原因，而胎盤缺氧損傷又可進(jìn)一步促進(jìn)sFlt-1 生成，引起血管生成失衡及胎盤損傷，從而加重PIH 進(jìn)程。PLGF 是胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞分化及內(nèi)皮細(xì)胞增殖過程中的重要因子。KIDRON等［21］研究表明，PLGF能促進(jìn)早孕時滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與分化，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移并抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，增加血管通透性，是重要的促血管生成因子，本研究發(fā)現(xiàn)，PIH 大鼠胎盤絨毛細(xì)胞數(shù)目減少的同時，也伴隨著sFlt-1 表達(dá)增高及PLGF 表達(dá)減少，提示這兩種變化也可能與PIH 大鼠胎盤組織損傷關(guān)系密切。

目前，臨床治療PIH 的主要藥物為硫酸鎂，但該藥不良反應(yīng)重，因此，尋找治療PIH 安全、有效的藥物是臨床研究重點［22］。中醫(yī)藥治療PIH 具有降壓效果好、不良反應(yīng)輕等優(yōu)點［23］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，中藥丹參注射液在降低PIH 患者及模型大鼠血壓、改善母嬰結(jié)局方面有一定療效，提示丹參可能是治療PIH 的潛在藥物，但其具體治療機(jī)制不甚清楚［12-13］。丹參素為丹參的主要活性物質(zhì)，臨床研究發(fā)現(xiàn)其在降血壓和改善微循環(huán)方面有較好療效［9-10］?；诖耍狙芯客茰y丹參素可能是治療PIH 的主要活性物質(zhì)，并建立PIH 大鼠模型進(jìn)行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參素低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠胎盤組織sFlt-1 表達(dá)降低，NO、PLGF、eNOs表達(dá)升高的同時，血壓及尿蛋白含量也降低，胎鼠死亡率、畸形率等不良妊娠結(jié)局發(fā)生率及胎盤結(jié)構(gòu)損傷等均得到顯著改善，且隨著丹參素劑量升高則效果越明顯。另外，丹參素低劑量組改善效果優(yōu)于陽性對照組，表明丹參素可減輕PIH 大鼠胎盤損傷、減少不良妊娠結(jié)局，對PIH 有較好的治療效果，其治療作用可能與抑制胎盤組織sFlt-1 表達(dá)、上調(diào)PLGF 表達(dá)，提高胎盤組織eNOs 活性和血清NO合成，改善胎盤血管功能有關(guān)。

綜上所述，丹參素可抑制胎盤組織sFlt-1 表達(dá)、上調(diào)PLGF表達(dá)，提高胎盤組織eNOs活性和血清NO合成，減輕PIH 大鼠胎盤血管功能受損，進(jìn)而改善妊娠結(jié)局，以上結(jié)果可為臨床治療PIH 提供一定參考。然而，PIH 病理過程相當(dāng)復(fù)雜，丹參素還可能通過其他途徑治療PIH，且丹參素改善PIH 血管功能的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。