杜 民，牛寶珍，雷美榕，普文華，彭躍穎，施來鳳，周 甜，古金華

(1.湖南文理學院/生命與環(huán)境科學學院，水產高效健康生產湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，環(huán)洞庭湖水產健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，水生動物重要疫病分子免疫技術湖南省重點實驗室，水產生物資源與環(huán)境生態(tài)湖南省工程研究中心，動物學湖南省高校重點實驗室，常德市農業(yè)生物大分子研究中心，湖南常德 415000；2.紅河學院,云南省高校農作物優(yōu)質高效栽培與安全控制重點實驗室 云南蒙自 661199)

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.2 DNA提取、PCR擴增、克隆和測序

表1 巨12S rRNA基因和ND3基因PCR反應所用引物Tab.1 Primers for PCR amplification of 12S rRNA and ND3 gene of B.yarrelli

表1 巨12S rRNA基因和ND3基因PCR反應所用引物Tab.1 Primers for PCR amplification of 12S rRNA and ND3 gene of B.yarrelli

目的基因引物引物序列(5′-3′)序列長度/bp文獻12SrRNABaya16FBaya16RBaya17FBaya17RCACACATCHAAACAACAAGGHAGGTGTGGCRTAGCAAGGCGTCTTATACATGCAAGTATCCGCATAAGCTAGCTGTTTRGCTCAGG14001000[13]ND3Baya9FBaya9RTACAAGAAAACGTATAATGGCCCCGAAATCAGAGGTCTTRTRT1258[13]

1.3 數(shù)據(jù)分析

表2 10種科魚類和登錄號Tab.2 Accession number and information of the ten oridae fishes in Genbank

表2 10種科魚類和登錄號Tab.2 Accession number and information of the ten oridae fishes in Genbank

Sis類屬GenBank登錄號ND3基因長度/bp序列相似率/%12SrRNA基因長度/bp序列相似率/%巨(B.yarrlli)屬(Bagarius)KT9834113468995496老撾紋胸(G.laosensis)紋胸屬(Glyptothorax)KP2714383498495792中華紋胸(G.sinensis)紋胸屬(Glyptothorax)KJ7396173498295891長絲黑(G.dolichonema)黑屬(Gagata)JQ0262503498595892鑿齒(G.andersonii)鑿齒屬(Glaridoglanis)JQ0262542958695791黑斑原(G.maculatum)原屬(Glyptosternon)JQ0262513497995891黃斑褶(P.sulcata)褶屬(Pseudecheneis)JQ0262593497895990藏(E.labiatum)屬(Exostoma)JQ0262552798195587大鰭異齒(O.macropterus)異齒屬(Oreoglanis)JQ02626131179扁頭異(C.kamengensis)異屬(Creteuchiloguis)JQ02625329586

2 結果與分析

取自3個河流5種群各12個個體樣本的12S rRNA序列同紅河河口群體12個個體比對得同源序列長度為954 bp，在這72個個體中發(fā)現(xiàn)有51個單倍型，其中取自怒江潞江壩河段的12個個體的序列中發(fā)現(xiàn)11個單倍型，瀾滄江景洪群體中存在有10個單倍型，瀾滄江臨滄群體中發(fā)現(xiàn)有11個單倍型，紅河曼耗群體中發(fā)現(xiàn)有7個單倍型，怒江三江口群體中共發(fā)現(xiàn)有9個單倍型，紅河河口群體中發(fā)現(xiàn)有6個單倍型；在954個位點中共檢測到246個保守位點，占25.8%，變異位點有708個，占74.2%，其中簡約變異信息位點678個，單個變異位點30個(表3)；堿基的轉換/顛換值為0.57(表3)；T、C、A、G堿基的平均含量分別為20.8%、25.7%、32.1%、21.4%，其中(A+T)含量52.9%高于(G+C)含量47.1%。

取自3個河流5種群各12個個體樣本的ND3序列同紅河河口群體12個個體的ND3序列經比對得同源序列長度為346 bp(瀾滄江景洪群體、紅河曼耗群體和紅河河口群體)和349 bp(瀾滄江臨滄群體、怒江潞江壩群體和怒江三江口群體)，在這72條序列中發(fā)現(xiàn)有42個單倍型，其中取自怒江潞江壩河段12個個體的序列中發(fā)現(xiàn)7個單倍型，瀾滄江景洪群體中存在有9個單倍型，瀾滄江臨滄群體中發(fā)現(xiàn)有10個單倍型，紅河曼耗群體中發(fā)現(xiàn)有6個單倍型，怒江三江口群體中共發(fā)現(xiàn)有8個單倍型，紅河河口群體中發(fā)現(xiàn)有5個單倍型；在349個位點中共檢測到247個保守位點，占70.8%，變異位點有102個，占29.2%，其中簡約變異信息位點77個，單個變異位點25個(表3)；堿基的轉換/顛換值為5.4(表3)；T、C、A、G堿基的平均含量分別為29.5%、28.2%、28.1%、14.1%，其中(A+T)含量57.6%高于(G+C)含量42.3%。

表3 巨12S rRNA和ND3基因序列位點信息Tab.3 Sites information of 12S rRNA and ND3 gene sequence in B.yarrelli

表3 巨12S rRNA和ND3基因序列位點信息Tab.3 Sites information of 12S rRNA and ND3 gene sequence in B.yarrelli

基因保守位點變異位點簡約信息位點單一位點比率(轉換/顛換)12SrRNA246708678300.57ND324710277255.4

表4 巨線粒體ND3基因序列密碼子及密碼子使用頻率Tab.4 Codon and its occurrence frequency of the mitochondrial ND3 gene in B.yarrelli

表4 巨線粒體ND3基因序列密碼子及密碼子使用頻率Tab.4 Codon and its occurrence frequency of the mitochondrial ND3 gene in B.yarrelli

密碼子計數(shù)密碼子使用頻率密碼子計數(shù)密碼子使用頻率密碼子計數(shù)密碼子使用頻率UUU(F)3.81.47UCU(S)3.11.39UAC(Y)1.21.52UUC(F)1.40.53UCC(S)1.70.77UAA(?)10.71UUA(L)3.21.63UCA(S)4.62.06UAG(?)00UUG(L)00.01UCG(S)0.10.04CAU(H)1.30.95CUU(L)0.90.43CCU(P)5.92.13CAC(H)1.51.05CUC(L)4.42.22CCC(P)2.91.05CAA(Q)12CUA(L)21.03CCA(P)2.30.82CAG(Q)00CUG(L)1.40.68CCG(P)00AAU(N)2.80.99AUU(I)61.58ACU(T)6.32.18AAC(N)2.81.01AUC(I)1.90.5ACC(T)3.11.07AAA(K)1.11.97AUA(I)3.40.91ACA(T)2.20.75AAG(K)00.03AUG(M)4.41ACG(T)00GAU(D)1.11.15GUU(V)0.10.17GCU(A)1.20.97GAC(D)0.80.85GUC(V)0.91.63GCC(A)2.31.93GAA(E)1.61.58GUA(V)0.71.27GCA(A)1.31.1GAG(E)0.40.42GUG(V)0.50.93GCG(A)00AGG(R)42UGU(C)1.50.9CGA(R)2.31.16GGU(G)11.6UGC(C)1.81.1CGG(R)00GGC(G)0.50.81UGA(?)3.32.29AGU(S)1.20.52GGA(G)11.55UGG(W)01AGC(S)2.71.22GGG(G)00.04CGU(R)10.51AGA(R)2.91.47CGC(R)1.70.86UAU(Y)0.40.48

表5 巨線粒體12S rRNA和ND3基因的遺傳多樣性及中性檢測Tab.5 Genetic diversity and neutral test of mitochondrial 12S rRNA and ND3 genes in B.yarrelli

表5 巨線粒體12S rRNA和ND3基因的遺傳多樣性及中性檢測Tab.5 Genetic diversity and neutral test of mitochondrial 12S rRNA and ND3 genes in B.yarrelli

基因種群樣本數(shù)單倍型數(shù)單倍型占比/%HdPiKTajima′sDFu′sFs12SrRNABaya-B121191.70.9850.0146313.93939-1.07983-1.912Baya-J121083.30.9550.0271525.848481.104020.772Baya-L121191.70.9850.0182417.37879-0.12932-1.364Baya-M12758.30.7730.002242.13636-1.94237-2.351Baya-N12975.00.9090.008888.43939-2.20100-0.739Baya-H12650.00.8640.002132.10606-1.19064-2.396總數(shù)725170.80.9720.0346331.41354-0.32355-7.502ND3Baya-B12758.30.8330.0306510.66667-0.886812.040Baya-J12975.00.9090.0574519.878791.958971.369Baya-L121083.30.9700.0122117.969700.82255-0.029Baya-M12650.00.6820.003851.33333-1.98343-2.456Baya-N12866.70.8480.018676.51515-2.05689-0.355Baya-H12541.70.5760.002891.00000-1.89423-1.899總數(shù)724258.30.9370.0787727.175670.74982-2.676

根據(jù)Mega5.02中的Kimura2-Parameter 計算得到的遺傳距離(見表6)可以看出，通過12S rRNA基因序列檢測到的51個單倍型的平均遺傳距離(轉換+顛換)為0.520，通過ND3基因序列檢測到42個單倍型平均遺傳距離為1.743(ND3>12S rRNA)，基于12S rRNA基因的51個單倍型所得到的轉換/顛換的平均值為0.57，基于ND3基因的42個單倍型所得到的轉換/顛換的平均值為5.4(ND3>12S rRNA)，其中12S rRNA基因序列檢測到的距離的最大值出現(xiàn)在瀾滄江景洪群體和瀾滄江臨滄群體間(1.062)，最小值出現(xiàn)在紅河曼耗群體和紅河河口群體間(0.004)；ND3基因中的最大值分別出現(xiàn)在怒江三江口群體和瀾滄江景洪群體(0.143)，同樣的其最小值也出現(xiàn)在了紅河曼耗群體和紅河河口群體間(0.008)，表明瀾滄江景洪群體與怒江三江口群體關系較遠，而紅河曼耗群體與紅河河口群體關系較近。

表6 巨種群間的遺傳距離Tab.6 Genetic distance between populations of B.yarrelli

表6 巨種群間的遺傳距離Tab.6 Genetic distance between populations of B.yarrelli

基因種群Baya-BBaya-JBaya-LBaya-MBaya-NBaya-H12SrRNABaya-B0.6620.9223.4144.1803.433Baya-J0.5950.5360.5930.6770.600Baya-L0.9131.0620.5640.5310.568Baya-M0.1580.5051.0414.074n/cBaya-N0.1220.5361.0190.0474.074Baya-H0.1580.5081.0430.0040.047ND3Baya-B6.3447.5906.8679.0156.449Baya-J0.1416.5786.4426.6915.998Baya-L0.0860.1305.6578.6875.254Baya-M0.1260.0780.1126.9491.340Baya-N0.0400.1430.0950.1296.544Baya-H0.1240.0800.1100.0080.128

注：正三角為轉換+顛換，倒三角為R=Si/Vi。

表7 巨種群內的遺傳距離Tab.7 Genetic distance in the population of B.yarrelli

表7 巨種群內的遺傳距離Tab.7 Genetic distance in the population of B.yarrelli

基因轉換/顛換Baya-BBaya-JBaya-MBaya-NBaya-LBaya-H轉換+顛換Baya-BBaya-JBaya-MBaya-NBaya-LBaya-H12SrRNA2.5981.104n/c7.4807.035n/c0.2330.2840.0040.0120.0200.003ND37.4604.481n/c14.217.0291.6750.0510.0590.0080.0370.0510.009

2.4 巨線粒體12S rRNA和ND3基因系統(tǒng)發(fā)育關系分析

本實驗利用3河流6種群51個單倍型的12S rRNA基因序列同科7屬8種魚類(見表2)進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，構建后的結果見圖1(左)，可看出屬與黑屬、紋胸屬匯聚成一大單系群，其中巨又可獨自匯成一支，支持率達到99%，據(jù)其類群的不同，又可分為兩大系群，一支即由怒江潞江壩群體、怒江三江口群體及瀾滄江臨滄群體所匯聚而成；另一支則由瀾滄江景洪群體、紅河曼耗和紅河河口群體所構成，其中瀾滄江景洪群體能構成一個單系種群，其支持率分別達到99%和99%，而褶屬、屬、鑿齒屬及原屬則構成另一單系群。同樣的將42個單倍型的ND3基因序列與科9屬10種魚類(見表2)進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，其結果見圖1(右)，可看出屬與異齒屬聚集成一支，其中巨也可獨自匯成一支，支持率為91%，同12S rRNA構建的系統(tǒng)樹相同，怒江潞江壩群體、怒江三江口群體及瀾滄江臨滄群體還是同樣地匯聚成一支，瀾滄江景洪群體能構成單系種群，支持率為100%和100%，而褶屬、屬、鑿齒屬、原屬、黑屬、紋胸屬及異屬則匯成另一支。

圖1 科7屬8種魚類及51個單倍型的12S rRNA基因序列NJ系統(tǒng)進化樹(左)和科9屬10種魚類及42個單倍型的ND3基因序列NJ系統(tǒng)進化樹(右)Fig.1 NJ phylogenetic tree(left) of 8 sisoridae species from 7 genera based on 51 haplotypes of 12S rRNA gene sequence and NJ phylogenetic tree(right) of 10 sisoridae species from 9 genera based on 42 haplotypes of ND3 gene sequence

3 討論

3.1 巨線粒體12S rRNA及ND3基因的結構特征

3.2 巨線粒體12S rRNA及ND3基因的遺傳多樣性

3.3 巨線粒體12S rRNA及ND3基因的遺傳距離

3.4 巨線粒體12S rRNA及ND3基因的系統(tǒng)發(fā)育樹