鄧 茹，陳 曦，裘麗萍,孟順龍，陳家長(zhǎng)

(1水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海海洋大學(xué))/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306；2中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(無(wú)錫)/中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院內(nèi)陸漁業(yè)生態(tài)環(huán)境和資源重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214081)

附著細(xì)菌是指水體中一類(lèi)依附在植物、有機(jī)碎屑以及其他物體表面上營(yíng)專(zhuān)性或兼性附著生活的細(xì)菌群體[1]。湖泊生態(tài)系統(tǒng)中附著細(xì)菌的數(shù)量可以達(dá)到105～107個(gè)/cm2，是湖泊水體中重要的初級(jí)生產(chǎn)者之一[2]。附著細(xì)菌在富營(yíng)養(yǎng)化水體中具有顯著的脫氮除磷作用，而且能促進(jìn)大分子有機(jī)化合物的礦化[3,4]，在重金屬吸附過(guò)程中附著細(xì)菌也發(fā)揮著重要作用[5,6]。大量附著微生物群體易在載體表面形成生物膜，而在生物膜中載體是核心部分，在環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用，載體的材質(zhì)、表面粗糙度、強(qiáng)度及密度等因素對(duì)水處理效果具有直接的影響[7-10]。

蔣建文等[11]采用PCR-DGGE技術(shù)研究了無(wú)紡布載體在池塘和水中表面微生物多樣性的差異。辛建美等[12]在研究生物膜對(duì)羅氏沼蝦育苗體系中水體的凈化效果中表明生物膜對(duì)水體中污染物的去除率較高，其研究?jī)H介紹了生物膜固著生物量的變化并未涉及對(duì)生物膜上微生物群落的具體分析。充分了解湖泊生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的組成、分布特征和功能，對(duì)湖泊生態(tài)環(huán)境的管理和維護(hù)具有重要意義[13,14]。高通量測(cè)序技術(shù)可以高通量獲得特定的DNA片段，全面展示生物群落的組成和結(jié)構(gòu)[15]。目前，國(guó)內(nèi)外研究人員采用該方法研究了微生物群落的組成、分布特征及其影響因素等[16-18]。PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by recon- struction of unobserved states) 是一個(gè)預(yù)測(cè)菌群功能和代謝的軟件，通過(guò)16S rRNA基因序列預(yù)測(cè)相應(yīng)細(xì)菌和古菌的代謝功能譜[19]。目前PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析很少應(yīng)用于微生物研究[20,21]，與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合將為探明微生物群落組成和功能提供重要幫助。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與附著基情況

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

DNA提取是根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用NanoDrop2000檢測(cè)DNA濃度和純度，1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。 PCR擴(kuò)增：

(1) 引物序列為338 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806 R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。

(2) 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性3 min；27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；最后72 ℃延伸10 min(PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型)。

(3) 擴(kuò)增體系20 μL：4 μL 5 FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.3 高通量測(cè)序及PICRUSt功能預(yù)測(cè)

PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠回收，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)進(jìn)行檢測(cè)定量。按照Illumina MiSeq(Illumina，San Diego,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將純化的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300文庫(kù)。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

PICRUSt功能預(yù)測(cè)是對(duì)OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；然后通過(guò)每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的greengene id，獲得OTU對(duì)應(yīng)的COG(Clusters of Orthologs Groups)家族信息和KEGG Orthology(KO)信息；并計(jì)算各COG的豐度和KO豐度。根據(jù)COG數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，可以從eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)中解析到各個(gè)COG的描述信息，以及其功能信息，從而得到功能豐度譜；根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，可以獲得KO、Pathway、EC信息，并能根據(jù)OTU豐度計(jì)算各功能類(lèi)別的豐度。此外，針對(duì)Pathway，運(yùn)用PICRUSt可獲得代謝通路的3個(gè)水平信息，并分別得到各個(gè)水平的豐度表。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

測(cè)序序列用Trimmomatic軟件控制，用FLASH軟件拼接。使用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，按照97%的相似度對(duì)OTU序列進(jìn)行聚類(lèi)，并在聚類(lèi)過(guò)程中剔除單序列和嵌合體。采用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每個(gè)序列的物種分類(lèi)進(jìn)行注釋?zhuān)⒈容^Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU123)，比較閾值為70%。Mothur軟件對(duì)序列進(jìn)行抽平計(jì)算多樣性指數(shù)Sobs、Shannon、Simpson、Ace、Chao1指數(shù)和Coverage。利用QIIME軟件及R語(yǔ)言制成稀釋曲線(xiàn)、Venn圖、主坐標(biāo)分析(principal co ordinates analysis，PCoA)。運(yùn)用Microsoft office和SP SS25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行顯著性標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線(xiàn)

圖1 稀釋曲線(xiàn)Fig.1 Rarefaction curves of OTU numbers

2.2.1 不同基質(zhì)細(xì)菌群落組成在門(mén)水平的分析

通過(guò)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)和物種組成分類(lèi)，從樣品中提取了42 207個(gè)微生物基因序列，共檢出38門(mén)?？砂l(fā)現(xiàn)在門(mén)分類(lèi)水平上(如圖2)，合并豐度>1%的數(shù)值共12門(mén)菌群，分別為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、浮霉菌(planctomycetes)、WS6、Saccharibacteria、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、Deinococcus-Thermns，以上菌門(mén)之和在各個(gè)樣品中占98.39%～98.74%。其中變形菌門(mén)是樣品中含量最高的門(mén)，所占比例分別為棕櫚基質(zhì)45.49%、網(wǎng)片基質(zhì)36.46%、人工水草基質(zhì)47.88%、蘆葦基質(zhì)50.80%。綠彎菌門(mén)是樣品中含量第二高的門(mén)，占棕櫚、網(wǎng)片、人工水草、蘆葦基質(zhì)的比例依次為20.02%、18.62%、13.04%、16.82%。而藍(lán)細(xì)菌為第三大優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其含量占棕櫚、網(wǎng)片、人工水草、蘆葦基質(zhì)的比例依次為14.33%、17.88%、11.32%、5.78%。可發(fā)現(xiàn)在蘆葦基質(zhì)上藍(lán)藻細(xì)菌含量顯著低于其它基質(zhì)，擬桿菌、WS6、厚壁菌門(mén)、Deinococcus-Thermns在蘆葦基質(zhì)上則顯著高于其它基質(zhì)。

圖2 門(mén)水平上物種相對(duì)豐度分布Fig.2 Distribution of relative abundance of species at the phylum level

2.2.2 不同基質(zhì)細(xì)菌群落組成在綱水平的分析

從綱水平上分析，共從樣品中提取了42 207個(gè)微生物基因序列，可分為91綱。其中相對(duì)豐度<1%的有20綱，分別是Alphaproteobacteria(α-變形桿菌綱)、Anaerolineae(厭氧繩菌綱)、Cyanobacteria(藍(lán)細(xì)菌綱)、Gammaproteobacteria(丙型變形菌綱)、Spartobacteria、Sphingobacteria(鞘脂桿菌門(mén))、Betaproteobacteria(β-變形菌綱)、Deltaproteobacteria(δ-變形菌綱)、Actnobacteria(放線(xiàn)菌綱)、Acidobacteria(酸桿菌綱)、Caidlineae(暖蠅菌綱)、Chloroflexia(綠屈撓菌屬)、Flavobateriia、Norank_p_WS6、Phycisphaerae、Cytophagia(纖維粘網(wǎng)菌)、Norank_p_Saccharibacteria、SM1A07、Clostridia(梭狀芽孢桿菌綱)、Deinococci(異常球菌屬)。從綱水平上物種相對(duì)豐度分布圖中可發(fā)現(xiàn)不同附著基質(zhì)上不同屬的菌群占比存在差異，且樣品中最高不超過(guò)3.68%為其它未確定分類(lèi)的微生物群落(圖3)，這證明在綱分類(lèi)水平上Illumina 測(cè)序是足夠準(zhǔn)確的。

圖3 綱水平上物種相對(duì)豐度分布Fig.3 Relative abundance distribution of species on the class level

2.2.3 不同基質(zhì)細(xì)菌群落組成在目水平的分析

從樣品中提取的42 207個(gè)微生物基因序列中可分為183目。如圖4所示在目分類(lèi)水平上，其中相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)目有28個(gè)，主要包括Anaerolineales(厭氧繩菌目)、Rhodobacterales(紅桿菌目)、Subsectionlll、Rhizobiales(根瘤菌目)、Chthoniobacterales、Sphinomonadales、Sphingobacteiales、Xanthomonadales(黃單胞菌目)、Rhodospirillales(紅螺菌目)、Burkholderiales(伯克氏菌目)、Subsectionl、Caulobacterales(柄桿菌目)等。從物種相對(duì)分布圖中可發(fā)現(xiàn)，厭氧蠅菌目在人工水草基質(zhì)上比其它基質(zhì)低，紅桿菌目在人工水草基質(zhì)和蘆葦基質(zhì)上的占比相似且均高于棕櫚片和網(wǎng)片基質(zhì)；蘆葦基質(zhì)上Subsectionlll和Chthoniobacterales的占比分別為3.64%和3.24%均顯著低于其它基質(zhì)占比。

圖4 目水平上物種相對(duì)豐度分布Fig.4 Relative abundance distribution of species on order level

2.2.4 不同基質(zhì)細(xì)菌群落組成在科水平的分析

通過(guò)高通量測(cè)序不同基質(zhì)附著樣品一共分為338科，從科水平上觀察發(fā)現(xiàn)厭氧蠅菌科在棕櫚片基質(zhì)和網(wǎng)片基質(zhì)上的平均相對(duì)豐度最高，在人工水草基質(zhì)和蘆葦基質(zhì)上的平均相對(duì)豐度次之；而紅桿菌科在人工水草基質(zhì)和蘆葦基質(zhì)上的平均相對(duì)豐度最高，在棕櫚片基質(zhì)和網(wǎng)片基質(zhì)上的平均相對(duì)豐度次之。除此之外，主要包括Familyl_O_Subsectionlll、LD29、Sphingomonadaceae(鞘脂單胞菌科)、Xanthomonadaceae(黃單胞菌科)、Erythrobacteraceae(赤桿菌科)、Saprospiraceae(腐螺旋菌科)、Hyphomonadacea(生絲單胞菌科)、Hyphomicrobiaceae(生絲微菌科)、Caldilineaceae(暖蠅菌科)、Comamonadaceae(叢毛單胞菌科)、Methylobacteriaceae(甲基桿菌科)、Chitinophagaceae等，通過(guò)物種相對(duì)豐度分布圖(圖5)可發(fā)現(xiàn)不同基質(zhì)附著細(xì)菌相對(duì)豐度在科水平上表現(xiàn)出顯著差異。

圖5 科水平上物種相對(duì)豐度分布Fig.5 Relative abundance distribution of species at the family level

2.2.5 不同基質(zhì)細(xì)菌群落組成在屬水平分析

樣品測(cè)序共檢測(cè)到646屬，通過(guò)Venn圖可以比較直觀地展現(xiàn)不同基質(zhì)附著樣本中物種組成相似性及重疊情況(如圖6)。從圖6中可發(fā)現(xiàn)四種不同基質(zhì)附著細(xì)菌大部分存在重疊菌屬，其中有435屬是屬于四種基質(zhì)共有的，而單獨(dú)存在于棕櫚片基質(zhì)、網(wǎng)片基質(zhì)、人工水草基質(zhì)、蘆葦基質(zhì)上的菌屬分別有10個(gè)、9個(gè)、14個(gè)、29個(gè)。從總的物種數(shù)目柱形圖可發(fā)現(xiàn)四種不同基質(zhì)附著細(xì)菌屬?gòu)母叩降鸵来螢椋禾J葦基質(zhì)>人工水草基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)>棕櫚片基質(zhì)。

圖6 屬水平細(xì)菌Venn圖Fig.6 Venn diagram of a genus of horizontal bacteria

2.3 鰣淀不同基質(zhì)附著細(xì)菌多樣性分析

2.3.1 不同基質(zhì)附著細(xì)菌α-多樣性分析

通過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)樣品進(jìn)行α-多樣性分析，得出多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表(表1)。根據(jù)表1可以看出所有樣品的覆蓋度均在98.7%以上，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)是有效可靠的，可以作為分析的依據(jù)。Sobs指數(shù)指的是實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)目，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)主要是用來(lái)衡量物種的多樣性，Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)主要是用來(lái)衡量

物種豐度，Coverage指數(shù)主要用于檢測(cè)物種覆蓋度。由表1可以看出，Sobs指數(shù)OTU數(shù)目平均大小為棕櫚片基質(zhì)>蘆葦基質(zhì)>人工水草基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)；從Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映出不同基質(zhì)多樣性大小依次為蘆葦基質(zhì)>棕櫚片基質(zhì)>人工水草基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)；從Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)可看出不同基質(zhì)附著細(xì)菌豐富度依次為棕櫚片基質(zhì)>蘆葦基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)>人工水草基質(zhì)。

表1 附著細(xì)菌的多樣性指數(shù)分析Tab.1 Analysis of diversity index of attached bacteria

2.3.2 不同基質(zhì)附著細(xì)菌β-多樣性分析

圖7 附著細(xì)菌多樣性的主坐標(biāo)分析Fig.7 Principal coordinate analysis of the diversity of attached bacteria

圖8 不同樣品 UPGMA 聚類(lèi)圖Fig.8 UPGMA cluster diagram of different samples

2.4 附著細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)分析

為了獲得附著細(xì)菌在不同基質(zhì)上的功能，本研究使用PICRUSt軟件對(duì)細(xì)菌種群進(jìn)行預(yù)測(cè)。基于COG數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(如圖9所示)，共涉及22個(gè)基因功能家族，顯示出功能上的豐富性。包括氨基酸運(yùn)輸和代謝；細(xì)胞膜/細(xì)胞壁/膜結(jié)構(gòu)的生物合成；能量轉(zhuǎn)換和產(chǎn)生；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；碳水化合物的運(yùn)輸和代謝；重建、復(fù)制和修復(fù)；翻譯、生物合成和核糖體結(jié)構(gòu)；轉(zhuǎn)錄；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、翻譯后修飾、伴侶蛋白；脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝以及輔酶的運(yùn)輸和代謝共十二大類(lèi)功能基因家族為主要功能基因家族，占比之和達(dá)70%以上，未能很好注釋的基本預(yù)測(cè)功能家族占比為8.39%～8.73%和未知功能基因家族占比為10.13%～10.61%。

圖9 不同基質(zhì)附著細(xì)菌PICRUSt功能預(yù)測(cè)Fig.9 PICRUSt function prediction of bacteria attached to different substrates

3 討論

3.1 不同基質(zhì)附著細(xì)菌群落組成及多樣性

3.2 PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析

4 結(jié)論

(2)對(duì)四種基質(zhì)α-多樣性分析發(fā)現(xiàn)附著細(xì)菌多樣性大小依次為蘆葦基質(zhì)>棕櫚片基質(zhì)>人工水草基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)，豐富度依次為棕櫚片基質(zhì)>蘆葦基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)>人工水草基質(zhì)。

(3)PCoA分析和基于Bray_curtis的UPGMA聚類(lèi)分析顯示，棕櫚片基質(zhì)與蘆葦基質(zhì)的附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，而網(wǎng)片基質(zhì)與人工水草基質(zhì)相似。

(4)采用PICRUSt軟件進(jìn)行的菌群預(yù)測(cè)分析表明，主要的COG功能包括氨基酸運(yùn)輸和代謝、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/膜結(jié)構(gòu)的生物合成、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝等共涉及22個(gè)功能基因家族，表現(xiàn)出功能上的豐富性。