鄧 茹，陳 曦，裘麗萍,孟順龍，陳家長

(1水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室(上海海洋大學(xué))/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306；2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風險評估實驗室(無錫)/中國水產(chǎn)科學(xué)研究院內(nèi)陸漁業(yè)生態(tài)環(huán)境和資源重點開放實驗室，江蘇無錫 214081)

附著細菌是指水體中一類依附在植物、有機碎屑以及其他物體表面上營專性或兼性附著生活的細菌群體[1]。湖泊生態(tài)系統(tǒng)中附著細菌的數(shù)量可以達到105～107個/cm2，是湖泊水體中重要的初級生產(chǎn)者之一[2]。附著細菌在富營養(yǎng)化水體中具有顯著的脫氮除磷作用，而且能促進大分子有機化合物的礦化[3,4]，在重金屬吸附過程中附著細菌也發(fā)揮著重要作用[5,6]。大量附著微生物群體易在載體表面形成生物膜，而在生物膜中載體是核心部分，在環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用，載體的材質(zhì)、表面粗糙度、強度及密度等因素對水處理效果具有直接的影響[7-10]。

蔣建文等[11]采用PCR-DGGE技術(shù)研究了無紡布載體在池塘和水中表面微生物多樣性的差異。辛建美等[12]在研究生物膜對羅氏沼蝦育苗體系中水體的凈化效果中表明生物膜對水體中污染物的去除率較高，其研究僅介紹了生物膜固著生物量的變化并未涉及對生物膜上微生物群落的具體分析。充分了解湖泊生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的組成、分布特征和功能，對湖泊生態(tài)環(huán)境的管理和維護具有重要意義[13,14]。高通量測序技術(shù)可以高通量獲得特定的DNA片段，全面展示生物群落的組成和結(jié)構(gòu)[15]。目前，國內(nèi)外研究人員采用該方法研究了微生物群落的組成、分布特征及其影響因素等[16-18]。PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by recon- struction of unobserved states) 是一個預(yù)測菌群功能和代謝的軟件，通過16S rRNA基因序列預(yù)測相應(yīng)細菌和古菌的代謝功能譜[19]。目前PICRUSt功能預(yù)測分析很少應(yīng)用于微生物研究[20,21]，與高通量測序技術(shù)相結(jié)合將為探明微生物群落組成和功能提供重要幫助。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與附著基情況

1.2 DNA提取與PCR擴增

DNA提取是根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)的說明書進行操作，用NanoDrop2000檢測DNA濃度和純度，1%瓊脂凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。 PCR擴增：

(1) 引物序列為338 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806 R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，對V3-V4可變區(qū)進行擴增。

(2) 擴增程序為：95 ℃ 預(yù)變性3 min；27個循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；最后72 ℃延伸10 min(PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型)。

(3) 擴增體系20 μL：4 μL 5 FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.3 高通量測序及PICRUSt功能預(yù)測

PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠回收，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測，利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)進行檢測定量。按照Illumina MiSeq(Illumina，San Diego,USA)標準操作規(guī)程，將純化的擴增片段構(gòu)建PE 2*300文庫。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。

PICRUSt功能預(yù)測是對OTU豐度表進行標準化；然后通過每個OTU對應(yīng)的greengene id，獲得OTU對應(yīng)的COG(Clusters of Orthologs Groups)家族信息和KEGG Orthology(KO)信息；并計算各COG的豐度和KO豐度。根據(jù)COG數(shù)據(jù)庫的信息，可以從eggNOG數(shù)據(jù)庫中解析到各個COG的描述信息，以及其功能信息，從而得到功能豐度譜；根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的信息，可以獲得KO、Pathway、EC信息，并能根據(jù)OTU豐度計算各功能類別的豐度。此外，針對Pathway，運用PICRUSt可獲得代謝通路的3個水平信息，并分別得到各個水平的豐度表。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

測序序列用Trimmomatic軟件控制，用FLASH軟件拼接。使用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，按照97%的相似度對OTU序列進行聚類，并在聚類過程中剔除單序列和嵌合體。采用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對每個序列的物種分類進行注釋，并比較Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)，比較閾值為70%。Mothur軟件對序列進行抽平計算多樣性指數(shù)Sobs、Shannon、Simpson、Ace、Chao1指數(shù)和Coverage。利用QIIME軟件及R語言制成稀釋曲線、Venn圖、主坐標分析(principal co ordinates analysis，PCoA)。運用Microsoft office和SP SS25軟件進行數(shù)據(jù)處理，進行顯著性標記。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of OTU numbers

2.2.1 不同基質(zhì)細菌群落組成在門水平的分析

通過Silva數(shù)據(jù)庫對所得數(shù)據(jù)進行比對和物種組成分類，從樣品中提取了42 207個微生物基因序列，共檢出38門?？砂l(fā)現(xiàn)在門分類水平上(如圖2)，合并豐度>1%的數(shù)值共12門菌群，分別為變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍細菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌(planctomycetes)、WS6、Saccharibacteria、厚壁菌門(Firmicutes)、Deinococcus-Thermns，以上菌門之和在各個樣品中占98.39%～98.74%。其中變形菌門是樣品中含量最高的門，所占比例分別為棕櫚基質(zhì)45.49%、網(wǎng)片基質(zhì)36.46%、人工水草基質(zhì)47.88%、蘆葦基質(zhì)50.80%。綠彎菌門是樣品中含量第二高的門，占棕櫚、網(wǎng)片、人工水草、蘆葦基質(zhì)的比例依次為20.02%、18.62%、13.04%、16.82%。而藍細菌為第三大優(yōu)勢菌門，其含量占棕櫚、網(wǎng)片、人工水草、蘆葦基質(zhì)的比例依次為14.33%、17.88%、11.32%、5.78%?？砂l(fā)現(xiàn)在蘆葦基質(zhì)上藍藻細菌含量顯著低于其它基質(zhì)，擬桿菌、WS6、厚壁菌門、Deinococcus-Thermns在蘆葦基質(zhì)上則顯著高于其它基質(zhì)。

圖2 門水平上物種相對豐度分布Fig.2 Distribution of relative abundance of species at the phylum level

2.2.2 不同基質(zhì)細菌群落組成在綱水平的分析

從綱水平上分析，共從樣品中提取了42 207個微生物基因序列，可分為91綱。其中相對豐度<1%的有20綱，分別是Alphaproteobacteria(α-變形桿菌綱)、Anaerolineae(厭氧繩菌綱)、Cyanobacteria(藍細菌綱)、Gammaproteobacteria(丙型變形菌綱)、Spartobacteria、Sphingobacteria(鞘脂桿菌門)、Betaproteobacteria(β-變形菌綱)、Deltaproteobacteria(δ-變形菌綱)、Actnobacteria(放線菌綱)、Acidobacteria(酸桿菌綱)、Caidlineae(暖蠅菌綱)、Chloroflexia(綠屈撓菌屬)、Flavobateriia、Norank_p_WS6、Phycisphaerae、Cytophagia(纖維粘網(wǎng)菌)、Norank_p_Saccharibacteria、SM1A07、Clostridia(梭狀芽孢桿菌綱)、Deinococci(異常球菌屬)。從綱水平上物種相對豐度分布圖中可發(fā)現(xiàn)不同附著基質(zhì)上不同屬的菌群占比存在差異，且樣品中最高不超過3.68%為其它未確定分類的微生物群落(圖3)，這證明在綱分類水平上Illumina 測序是足夠準確的。

圖3 綱水平上物種相對豐度分布Fig.3 Relative abundance distribution of species on the class level

2.2.3 不同基質(zhì)細菌群落組成在目水平的分析

從樣品中提取的42 207個微生物基因序列中可分為183目。如圖4所示在目分類水平上，其中相對豐度大于1%的優(yōu)勢目有28個，主要包括Anaerolineales(厭氧繩菌目)、Rhodobacterales(紅桿菌目)、Subsectionlll、Rhizobiales(根瘤菌目)、Chthoniobacterales、Sphinomonadales、Sphingobacteiales、Xanthomonadales(黃單胞菌目)、Rhodospirillales(紅螺菌目)、Burkholderiales(伯克氏菌目)、Subsectionl、Caulobacterales(柄桿菌目)等。從物種相對分布圖中可發(fā)現(xiàn)，厭氧蠅菌目在人工水草基質(zhì)上比其它基質(zhì)低，紅桿菌目在人工水草基質(zhì)和蘆葦基質(zhì)上的占比相似且均高于棕櫚片和網(wǎng)片基質(zhì)；蘆葦基質(zhì)上Subsectionlll和Chthoniobacterales的占比分別為3.64%和3.24%均顯著低于其它基質(zhì)占比。

圖4 目水平上物種相對豐度分布Fig.4 Relative abundance distribution of species on order level

2.2.4 不同基質(zhì)細菌群落組成在科水平的分析

通過高通量測序不同基質(zhì)附著樣品一共分為338科，從科水平上觀察發(fā)現(xiàn)厭氧蠅菌科在棕櫚片基質(zhì)和網(wǎng)片基質(zhì)上的平均相對豐度最高，在人工水草基質(zhì)和蘆葦基質(zhì)上的平均相對豐度次之；而紅桿菌科在人工水草基質(zhì)和蘆葦基質(zhì)上的平均相對豐度最高，在棕櫚片基質(zhì)和網(wǎng)片基質(zhì)上的平均相對豐度次之。除此之外，主要包括Familyl_O_Subsectionlll、LD29、Sphingomonadaceae(鞘脂單胞菌科)、Xanthomonadaceae(黃單胞菌科)、Erythrobacteraceae(赤桿菌科)、Saprospiraceae(腐螺旋菌科)、Hyphomonadacea(生絲單胞菌科)、Hyphomicrobiaceae(生絲微菌科)、Caldilineaceae(暖蠅菌科)、Comamonadaceae(叢毛單胞菌科)、Methylobacteriaceae(甲基桿菌科)、Chitinophagaceae等，通過物種相對豐度分布圖(圖5)可發(fā)現(xiàn)不同基質(zhì)附著細菌相對豐度在科水平上表現(xiàn)出顯著差異。

圖5 科水平上物種相對豐度分布Fig.5 Relative abundance distribution of species at the family level

2.2.5 不同基質(zhì)細菌群落組成在屬水平分析

樣品測序共檢測到646屬，通過Venn圖可以比較直觀地展現(xiàn)不同基質(zhì)附著樣本中物種組成相似性及重疊情況(如圖6)。從圖6中可發(fā)現(xiàn)四種不同基質(zhì)附著細菌大部分存在重疊菌屬，其中有435屬是屬于四種基質(zhì)共有的，而單獨存在于棕櫚片基質(zhì)、網(wǎng)片基質(zhì)、人工水草基質(zhì)、蘆葦基質(zhì)上的菌屬分別有10個、9個、14個、29個。從總的物種數(shù)目柱形圖可發(fā)現(xiàn)四種不同基質(zhì)附著細菌屬從高到低依次為：蘆葦基質(zhì)>人工水草基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)>棕櫚片基質(zhì)。

圖6 屬水平細菌Venn圖Fig.6 Venn diagram of a genus of horizontal bacteria

2.3 鰣淀不同基質(zhì)附著細菌多樣性分析

2.3.1 不同基質(zhì)附著細菌α-多樣性分析

通過測序數(shù)據(jù)對結(jié)果進行比對，并對樣品進行α-多樣性分析，得出多樣性指數(shù)統(tǒng)計表(表1)。根據(jù)表1可以看出所有樣品的覆蓋度均在98.7%以上，說明測序數(shù)據(jù)是有效可靠的，可以作為分析的依據(jù)。Sobs指數(shù)指的是實際觀測到的OTU數(shù)目，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)主要是用來衡量物種的多樣性，Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)主要是用來衡量

物種豐度，Coverage指數(shù)主要用于檢測物種覆蓋度。由表1可以看出，Sobs指數(shù)OTU數(shù)目平均大小為棕櫚片基質(zhì)>蘆葦基質(zhì)>人工水草基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)；從Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映出不同基質(zhì)多樣性大小依次為蘆葦基質(zhì)>棕櫚片基質(zhì)>人工水草基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)；從Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)可看出不同基質(zhì)附著細菌豐富度依次為棕櫚片基質(zhì)>蘆葦基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)>人工水草基質(zhì)。

表1 附著細菌的多樣性指數(shù)分析Tab.1 Analysis of diversity index of attached bacteria

2.3.2 不同基質(zhì)附著細菌β-多樣性分析

圖7 附著細菌多樣性的主坐標分析Fig.7 Principal coordinate analysis of the diversity of attached bacteria

圖8 不同樣品 UPGMA 聚類圖Fig.8 UPGMA cluster diagram of different samples

2.4 附著細菌群落功能預(yù)測分析

為了獲得附著細菌在不同基質(zhì)上的功能，本研究使用PICRUSt軟件對細菌種群進行預(yù)測?；贑OG數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果顯示(如圖9所示)，共涉及22個基因功能家族，顯示出功能上的豐富性。包括氨基酸運輸和代謝；細胞膜/細胞壁/膜結(jié)構(gòu)的生物合成；能量轉(zhuǎn)換和產(chǎn)生；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制；無機離子轉(zhuǎn)運與代謝；碳水化合物的運輸和代謝；重建、復(fù)制和修復(fù)；翻譯、生物合成和核糖體結(jié)構(gòu)；轉(zhuǎn)錄；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、翻譯后修飾、伴侶蛋白；脂質(zhì)運輸和代謝以及輔酶的運輸和代謝共十二大類功能基因家族為主要功能基因家族，占比之和達70%以上，未能很好注釋的基本預(yù)測功能家族占比為8.39%～8.73%和未知功能基因家族占比為10.13%～10.61%。

圖9 不同基質(zhì)附著細菌PICRUSt功能預(yù)測Fig.9 PICRUSt function prediction of bacteria attached to different substrates

3 討論

3.1 不同基質(zhì)附著細菌群落組成及多樣性

3.2 PICRUSt功能預(yù)測分析

4 結(jié)論

(2)對四種基質(zhì)α-多樣性分析發(fā)現(xiàn)附著細菌多樣性大小依次為蘆葦基質(zhì)>棕櫚片基質(zhì)>人工水草基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)，豐富度依次為棕櫚片基質(zhì)>蘆葦基質(zhì)>網(wǎng)片基質(zhì)>人工水草基質(zhì)。

(3)PCoA分析和基于Bray_curtis的UPGMA聚類分析顯示，棕櫚片基質(zhì)與蘆葦基質(zhì)的附著細菌群落結(jié)構(gòu)相似，而網(wǎng)片基質(zhì)與人工水草基質(zhì)相似。

(4)采用PICRUSt軟件進行的菌群預(yù)測分析表明，主要的COG功能包括氨基酸運輸和代謝、細胞壁/細胞膜/膜結(jié)構(gòu)的生物合成、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制、無機離子轉(zhuǎn)運與代謝、碳水化合物的運輸和代謝等共涉及22個功能基因家族，表現(xiàn)出功能上的豐富性。