鄒輝鑫
(南陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南 南陽 473000)
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種與脂代謝、胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)等相關(guān)的臨床綜合征[1],主要病理特征為彌漫性肝細(xì)胞脂肪沉積和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性,但NAFLD的發(fā)病機(jī)制目前仍未完全明確,同時(shí)其發(fā)病率近年來不斷攀升,成為威脅人類健康的重要問題[2]。有報(bào)道指出[3],NAFLD與代謝綜合征有緊密聯(lián)系;近年來的研究認(rèn)為不同糖代謝的NAFLD患者腸道菌群變化較為顯著[4];腫瘤壞死因子-α(Tumour necrosis factor-α,TNF-α)能促進(jìn)炎性因子釋放加重肝細(xì)胞損傷;粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony factor,GM-CSF)是一種造血因子,其在血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)大量釋放,進(jìn)而調(diào)控機(jī)體免疫;可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體(Soluble triggering receptors expressedon myeloid cells,sTREM-1)則是近些年發(fā)現(xiàn)的感染預(yù)測(cè)因子,預(yù)測(cè)敗血癥等方面效果頗佳[5]。目前NAFLD的血清學(xué)指標(biāo)與腸道菌群均有相關(guān)研究[6-7],但涉及上述指標(biāo)的較為少見,基于此,本研究分析NAFLD患者血清GM-CSF、和sTREM-1、TNF-α水平和腸道菌群變化關(guān)聯(lián)性,為探明NAFLD的發(fā)病機(jī)制提供較好的理論依據(jù)。
1.1 臨床資料 選取2019年6月至2021年7月于本院收治的72例NAFLD患者為病例組,并根據(jù)不同預(yù)后情況將病例組分為預(yù)后不佳組和預(yù)后良好組,另外征集同期于本院體檢健康者30例作為對(duì)照組,病例組男45例、女27例,平均年齡(48.57±10.38)歲,體質(zhì)指數(shù)(24.02±3.45)kg/m2;對(duì)照組男19例、女11例,平均年齡(49.12±9.79)歲,體質(zhì)指數(shù)(23.34±2.76)kg/m2。兩組組間一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
納入標(biāo)準(zhǔn):⑴符合臨床對(duì)NAFLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8],經(jīng)影像學(xué)檢測(cè),肝臟近場(chǎng)回聲增強(qiáng),遠(yuǎn)場(chǎng)回聲減弱,且肝臟管道結(jié)構(gòu)顯示模糊;⑵患者對(duì)研究了解知情。排除標(biāo)準(zhǔn):⑴酒精性脂肪性肝?。虎坪喜⑿?、肺、腎等臟器患嚴(yán)重疾病;⑶近期服用腸動(dòng)力藥、微生物制劑;⑷因病毒性肝炎、腎功能不全、血液疾病等導(dǎo)致脂肪肝;⑸妊娠、孕期婦女;⑹既往有胃腸道病史。
1.2 方法 ⑴血清標(biāo)本檢測(cè):入組后清晨采集所有受試者的靜脈血標(biāo)本,靜置1 h,使用低速離心機(jī)(中科中佳,SC-3616)于室溫中1500 r/min離心20min,取上清裝于EP管,送至低溫冰箱封存,融凍一天后樣本未出現(xiàn)溶血、絮狀現(xiàn)象,外觀無異常,進(jìn)行下一步檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平,試劑盒購自北京中杉金橋生物公司,檢測(cè)步驟按照說明書進(jìn)行操作。同時(shí)使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定空腹血糖(Fasting blood glucose,FPG),空腹胰島素(Fasting insulin,FINS),另外用胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment,HOMA-IR)表示胰島素敏感性和IR程度,根據(jù)計(jì)算公式HOMA-IR=FPG×FINS/22.5;⑵腸道菌群檢測(cè):入組后采集所有受試者的糞便0.5 g,制成標(biāo)本送檢,用連續(xù)稀釋法稀釋成10~1至10~7后,依照各菌種的正常菌數(shù)范圍進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),厭氧型置入?yún)捬鹾袃?nèi)在恒溫箱培育72 h,需氧型置入有氧環(huán)境中,在恒溫箱培育24 h,統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基上的菌落數(shù),檢測(cè)雙歧桿菌、酵母菌、腸桿菌、腸球菌的菌群數(shù)量,轉(zhuǎn)化成對(duì)數(shù)值(LgCFU/g),來定量表示腸道菌群的水平,并計(jì)算雙歧桿菌/腸桿菌比值(B/E);⑶腸道菌群Alpha多樣性指數(shù):所有受試者入組后行腸鏡檢測(cè),在距肛門20 cm處提取1塊黏膜組織進(jìn)行檢測(cè),使用細(xì)菌基因組DNA試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技公司),應(yīng)用Novaseq PE250(美國Illumina公司)進(jìn)行上機(jī)質(zhì)檢、測(cè)序,根據(jù)說明書操作步驟,提取黏膜組織DNA,使用Uparse軟件對(duì)測(cè)序得到的有效序列進(jìn)行分類[9],得到分類單元(Operational taxonomic units,OTU),使用Alpha分析對(duì)腸道菌群多樣性進(jìn)行觀察,包括Chao1、Shannon、Simpson指數(shù),Chao1指數(shù)估計(jì)樣本所含OTU的總數(shù),Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)估計(jì)微生物樣本群落的多樣性。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用IBM SPSSStatistics 24.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對(duì)正態(tài)分布的計(jì)量資料以(±s)表示,采用獨(dú)立t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料使用率(%)表示,行χ2檢驗(yàn),采用Spearman法分析腸道菌群水平與血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平的相關(guān)性,采用ROC曲線分析血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α對(duì)NAFLD預(yù)后的評(píng)估效能,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 兩組腸道菌群變化比較 結(jié)果顯示,病例組的雙歧桿菌、酵母菌數(shù)目和B/E值顯著低于對(duì)照組,腸桿菌、腸球菌數(shù)目顯著高于對(duì)照組(P<0.05),見表1。
表1 兩組腸道菌群變化比較(LgCFU/g,±s)
表1 兩組腸道菌群變化比較(LgCFU/g,±s)
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2.2 兩組腸道菌群多樣性比較 結(jié)果顯示,兩組的Chao1指數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);病例組的Shannon指數(shù)低于對(duì)照組,而Simpson指數(shù)高于對(duì)照組(P<0.05),見表2。
表2 兩組腸道菌群多樣性比較(±s)
表2 兩組腸道菌群多樣性比較(±s)
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2.3 兩組血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較 結(jié)果顯示,病例組的GM-CSF、sTREM-1以及TNF-α水平均高于對(duì)照組(P<0.05),見表3。
表3 兩組血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較(±s)
表3 兩組血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較(±s)
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2.4 兩組其他生化指標(biāo)比較 結(jié)果顯示,病例組的FPG、FINS以及HOMA-IR均高于對(duì)照組(P<0.05),見表4。
表4 兩組其他生化指標(biāo)比較(±s)
表4 兩組其他生化指標(biāo)比較(±s)
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2.5 NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平與B/E相關(guān)性分析結(jié)果 采用Spearman法分析腸道菌群水平與血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平的相關(guān)性,結(jié)果顯示,GM-CSF、sTREM-1、TNFα、HOMA-IR與B/E呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),見表5。
表5 NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平與B/E相關(guān)性分析結(jié)果
2.6 不同預(yù)后情況NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較 結(jié)果顯示,預(yù)后不佳組的GM-CSF、sTREM-1以及TNF-α水平均高于預(yù)后良好組(P<0.05),見表6。
表6 不同預(yù)后情況NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較(±s)
表6 不同預(yù)后情況NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較(±s)
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2.7 GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平對(duì)NAFLD患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值 結(jié)果顯示,采用ROC曲線分析GM-CSF、sTREM-1、TNF-α對(duì)大腸癌圍術(shù)期感染患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值,GM-CSF、sTREM-1、TNF-α評(píng)估NAFLD患者預(yù)后的AUC為0.811(95%CI:0.701~0.894)、0.800(95%CI:0.689~0.885)、0.808(95%CI:0.699~0.892),TNF-α敏感度最好為75.00%,GM-CSF特異度較高為86.36%,見表7、圖1。
表7 GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平對(duì)NAFLD患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值
圖1 GM-CSF、sTREM-1、TNF-α評(píng)估NAFLD患者預(yù)后的ROC曲線
NAFLD被認(rèn)為是一種與IR、遺傳易感性等關(guān)系緊密的應(yīng)激性肝受損,較早前已成為歐洲國家較常見的肝病原因,近年來發(fā)病率更是顯示上升的趨勢(shì)。NAFLD的臨床危險(xiǎn)因素也呈現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)[10],如肥胖、高血壓、糖尿病和代謝綜合征等,部分NAFLD患者可能發(fā)展成為肝硬化,然而由于NAFLD臨床癥狀無明顯特點(diǎn),大多數(shù)患者易忽視進(jìn)而造成漏診、誤診。同時(shí)由于該病與代謝綜合征等關(guān)聯(lián)緊密,導(dǎo)致患者機(jī)體代謝紊亂,造成全身性危害,許多患者發(fā)展為肝硬化之前可能已病死于心血管疾病[11]。目前臨床診斷NAFLD的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是肝組織病理活檢,可囿于其創(chuàng)傷性,無法全面推廣,而近些年的無創(chuàng)評(píng)估NAFLD病情的工具,均無法取代病理活檢來檢測(cè)患者肝纖維化程度,尋找評(píng)估NAFLD的血清、生化指標(biāo)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[12]。本研究基于此背景進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)NAFLD患者腸道菌群變化和血清細(xì)胞因子GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平存在較好相關(guān)性,且三者水平變化與腸道菌群失衡共同作用,可能導(dǎo)致NAFLD的產(chǎn)生,這一發(fā)現(xiàn)在近年來NAFLD的相關(guān)研究中并不多見,可為研究創(chuàng)新之處,現(xiàn)報(bào)告如下。
腸道菌群棲息在人體腸道內(nèi)的微生物群落,種類多、數(shù)量大。人體腸道內(nèi)含有大量細(xì)菌,而不同階段和環(huán)境,腸道菌群數(shù)量都有不同的變化,但對(duì)于健康機(jī)體而言,腸道菌群始終保持著動(dòng)態(tài)平衡。本研究結(jié)果顯示,病例組的雙歧桿菌、酵母菌數(shù)目和B/E值顯著低于對(duì)照組,腸桿菌、腸球菌數(shù)目顯著高于對(duì)照組,提示相比常人,NAFLD患者的腸道菌群明顯失調(diào)。分析原因,可能是NAFLD患者因肝病變和膽汁異常分泌,腸道內(nèi)pH失調(diào),結(jié)合型膽汁酸抑制腸道外細(xì)菌的作用降低,繼而導(dǎo)致體內(nèi)腸道菌群失衡[13];另外由于NAFLD與代謝綜合征的密切關(guān)系,可能引發(fā)患者消化道功能異常,胃腸道動(dòng)力不足、蠕動(dòng)減少,腸道清除功能降低,導(dǎo)致大量細(xì)菌過度繁殖,也可能造成菌群失衡。另一方面,研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)病例組的Shannon指數(shù)低于對(duì)照組,而Simpson指數(shù)高于對(duì)照組。Shannon指數(shù)代表菌群多樣性,Simpson指數(shù)代表菌群豐富度,Shannon指數(shù)值越大,表示多樣性越好,Simpson指數(shù)越大,種類越單一,本結(jié)果提示NAFLD患者的腸道菌群多樣性較常人明顯減少。聯(lián)系上述腸道菌群數(shù)目的結(jié)果來看,NAFLD的腸道菌群失衡、多樣性減少可能與NAFLD的發(fā)病有重要關(guān)聯(lián)[14]。
此外,結(jié)果顯示,病例組的GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平和FPG、FINS、HOMA-IR均高于對(duì)照組,說明NAFLD患者相比常人,體內(nèi)炎癥反應(yīng)較明顯,并已出現(xiàn)血糖代謝紊亂和IR現(xiàn)象。造成這一現(xiàn)象,推測(cè)原因可能是腸道菌群失調(diào),導(dǎo)致腸道通透性增加,促進(jìn)細(xì)菌移動(dòng),激活細(xì)胞免疫反應(yīng),從而加重炎癥反應(yīng)。另一方面,研究結(jié)果表明GM-CSF、sTREM-1、TNF-α、HOMA-IR與B/E值均呈負(fù)相關(guān),B/E值代表厭氧菌抑制致病菌定值腸道的能力,可全面地反映腸道菌群變化情況,因而上述結(jié)果提示腸道菌群的失調(diào)可能與GM-CSF、TNF-α的水平高低和HOMA-IR相關(guān),考慮到GM-CSF和TNF-α的功能,分析可能是肝細(xì)胞受損時(shí)促進(jìn)GM-CSF大量釋放,激活免疫反應(yīng),加重肝臟病變,而TNF-α的上升代表體內(nèi)炎癥反應(yīng)嚴(yán)重,細(xì)胞浸潤較深,破壞腸黏膜屏障,進(jìn)而腸道菌群失衡,同樣導(dǎo)致肝臟病變發(fā)生,形成惡性循環(huán)[15]。至于sTREM-1與腸道菌群失衡的關(guān)系,推測(cè)是sTREM-1誘導(dǎo)級(jí)聯(lián)式的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腸黏膜受損,引發(fā)菌群失衡,具體作用機(jī)制尚需要更深入地研究予以闡明。
最后,研究發(fā)現(xiàn),預(yù)后不佳組患者的GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平高于預(yù)后良好組,同時(shí)ROC曲線分析顯示GM-CSF、sTREM-1、TNF-α評(píng)估NAFLD患者預(yù)后的AUC為0.811、0.800、0.808,提示GM-CSF、sTREM-1、TNF-α具 有 較 好 評(píng) 估NAFLD預(yù)后的效能;亦有研究表明[16-17],NAFLD的預(yù)后存在多種危險(xiǎn)因子,其中包括遺傳因素、基礎(chǔ)疾病、手術(shù)等,這些因素皆有可能對(duì)血清標(biāo)志物GM-CSF、sTREM-1、TNF-α的評(píng)估效能造成一定影響,因此若臨床將該指標(biāo)納入評(píng)估指標(biāo)中,仍需聯(lián)系實(shí)際因素綜合進(jìn)行考慮。
綜上,NAFLD患者腸道菌群失衡較為明顯,且GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平異常上調(diào),腸道菌群變化與GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平有重要相關(guān),可能共同作用導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生,另外GM-CSF、sTREM-1、TNF-α能有效評(píng)估NAFLD預(yù)后。同時(shí)本研究存在一定局限性,研究樣本偏少,并且未對(duì)NAFLD病情有效分類以分析不同病情患者的腸道菌群和血清學(xué)指標(biāo)的聯(lián)系,這些有待于之后擴(kuò)大樣本量,行全面性的研究,予以進(jìn)一步探討。