雷健，伍柏青，杜宇娜，李蓉

（江西省人民醫(yī)院、南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006）

血液學(xué)參數(shù)在血液常規(guī)檢查中一直被認為是全身炎癥反應(yīng)的標(biāo)志[1-2]。血小板檢驗，作為血常規(guī)檢驗的一部分，對患者移植后的評估具有重要臨床意義[3]。BECKMAN COULTER DXH800全自動血細胞分析儀（簡稱UniCel DxH 800）是一款在臨床實驗室中使用較多的血液分析儀，它通過應(yīng)用全新的專利技術(shù)和設(shè)計，提高了儀器的準(zhǔn)確度、精確度、敏感性和特異性，但我們在臨床檢驗工作中發(fā)現(xiàn)其在血小板參數(shù)的檢驗方面仍有不足。器官移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)(Acute rejection,AR)增加了移植物功能不全的風(fēng)險，是影響移植物長期存活的主要因素。研究表明，大血小板的檢測對實行移植手術(shù)后的急性排斥反應(yīng)診斷有一定的輔助作用[3]。

我們回顧性觀察分析使用DXH800全自動血細胞分析儀檢測移植手術(shù)后患者血常規(guī)標(biāo)本中的大血小板的準(zhǔn)確性，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料 對2021年8月24日至2021年9月11日在江西省人民醫(yī)院使用DXH 800全自動血細胞分析儀進行血常規(guī)檢查的器官移植患者共602例進行篩選，包括在器官移植科、器官移植科ICU住院的患者和在器官移植科門診就診的患者。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：在近兩年在我院器官移植科進行了肝或腎同種異體移植術(shù)，供受者血型相符，淋巴細胞毒實驗陰性，群體反應(yīng)性抗體陰性，HLA配型檢測A、B、DR共3個位點，錯配1～4個位點；截止至2021年9月11日，患者最后一次血常規(guī)結(jié)果中血小板計數(shù)＜100×10^9/L。

腎移植術(shù)后AR診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)為尿量明顯減少、血壓升高、發(fā)熱、移植腎區(qū)脹痛；實驗室檢查血肌酐明顯升高；移植腎彩色多普勒超聲檢查移植腎各級動脈血管阻力指數(shù)升高（RI＞0.75）[4-5];移植腎穿刺活檢病理符合Banff標(biāo)準(zhǔn)[6]。肝移植術(shù)后AR診斷標(biāo)準(zhǔn)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）和直接膽紅素（DBIL）逐漸增高；彩色多普勒超聲檢測移植肝肝動脈血流信號明顯減少且阻力指數(shù)升高，肝靜脈頻譜形態(tài)變化，波幅下降，頻譜變鈍[7-8]。

本研究共篩選觀察分析對象37例，其中男性30例，女性7例，年齡28～64歲，平均年齡47.2歲。

1.2 儀器與材料 BECKMAN COULTER DXH800血細胞分析儀及配套的試劑和質(zhì)控品；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡；貝索瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液。

1.3方法 用EDTA抗凝管采集患者的靜脈血2 ml，顛倒混勻5～10次后備用。標(biāo)本檢測嚴格按照血液分析儀操作規(guī)程進行操作并得到血小板計數(shù)結(jié)果和血小板直方圖。將患者的靜脈血推片使用瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液染色，通過顯微鏡觀察血小板數(shù)量、形態(tài)，確定有無大血小板和巨血小板及其數(shù)量多少。

血小板數(shù)量的評估方法參照國際血液學(xué)復(fù)檢專家組推薦的方法[9]：在油鏡下，在血涂片分布良好的區(qū)域，一個血小板大約相當(dāng)10*10^9/L的血小板計數(shù)量。每個血涂片在油鏡下觀察20個左右的視野，將每個視野下觀察到的血小板數(shù)量進行統(tǒng)計并取平均值，作為該血液樣本的血小板數(shù)量相對真實值。

2 結(jié)果

2.1 我們對上述篩選出的37份患者血小板計數(shù)<100×10^9/L的血常規(guī)結(jié)果進行觀察分析，其中有13份標(biāo)本的血小板直方圖曲線出現(xiàn)異常，主要表現(xiàn)為直方圖曲線不呈現(xiàn)為對數(shù)正態(tài)擬合曲線，占比35.1%。對此13份標(biāo)本進行鏡檢觀察和統(tǒng)計，見表1。 此13份標(biāo)本中都觀察到大血小板現(xiàn)象，平均每油鏡視野0～3個大血小板。

表1 13例血小板直方圖曲線異常標(biāo)本的血小板儀器計數(shù)與鏡檢計數(shù)

2.2 對上述13位病例的病歷、用藥情況和檢驗結(jié)果進行分析，結(jié)果表明，13位患者之間均有高度的相似性，因此，我們從13位病例患者中選取1例進行病例分析。

該病例于2021年8月27日因腹部不適5年余，發(fā)現(xiàn)肝占位性病變1月余，我院以“肝炎后肝硬化失代償期”收入器官移植科診治。入院后，對患者進行各項體格檢查，完善相關(guān)影像學(xué)檢查和血液學(xué)檢驗，血小板計數(shù)166×10^9/L，血小板直方圖無異常。于2021年08月27日進行肝移植。術(shù)后因供肝在重癥醫(yī)學(xué)科治療過，有潛在感染機率，結(jié)合供體標(biāo)本送檢結(jié)果予以聯(lián)合抗感染治療，同時予以免疫抑制、改善貧血及低蛋白血癥、改善凝血功能、預(yù)防血管栓塞、護肝、制酸護胃、化痰、支持等治療。當(dāng)日術(shù)后血小板計數(shù)下降至90×10^9/L，術(shù)后第二日（8月28日至9月6日）儀器血小板計數(shù)<100×10^9/L，9月10日血小板計數(shù)回升至187×10^9/L，期間儀器血小板計數(shù)結(jié)果變化，見圖1。

圖1 儀器血小板計數(shù)結(jié)果變化

通過觀察，發(fā)現(xiàn)從8月29日至9月6日，血小板直方圖有尾部抬高現(xiàn)象，以9月3日血常規(guī)結(jié)果為例，見圖2。選取9月6日的血常規(guī)標(biāo)本進行推片鏡檢，在油鏡視野下可檢見大血小板，見圖3。平均每油鏡視野可檢見0～2個大血小板。該血常規(guī)標(biāo)本中儀器血小板計數(shù)為70×10^9/L，通過推片鏡檢血小板計數(shù)相對真實值約為83×10^9/L，兩次血小板計數(shù)結(jié)果存在較大差異。結(jié)合患者其他影像學(xué)檢查和肝功能檢查，ALT和AST明顯升高，可以判斷患者移植肝存在肝功能不全，患者存在一定的排斥反應(yīng)。通過使用甲潑尼龍和他克莫司等抗排斥藥物，9月10日患者肝功能基本恢復(fù)到正常水平，血小板數(shù)量恢復(fù)到正常水平，血小板直方圖趨于正常。

圖2 患者血常規(guī)結(jié)果及直方圖

圖3 患者血推片鏡檢結(jié)果

其他12位病例病史基本相似，在行移植術(shù)后，血小板數(shù)量下降至100×10^9/L以下，血小板直方圖出現(xiàn)異常，尾部異常抬高，推片可發(fā)現(xiàn)大血小板，結(jié)合其他相關(guān)檢查可斷定存在AR反應(yīng)。通過使用抗排斥藥物后，可見移植物功能恢復(fù)良好，血小板數(shù)量和形態(tài)恢復(fù)至正常水平。

3 討論

傳統(tǒng)的顯微鏡直接鏡檢法由于對檢驗師技術(shù)水平要求高、操作時間長、計數(shù)重復(fù)性差等原因，目前已基本被血液分析儀法取代。不同品牌的血液分析儀其檢測血小板的原理并不完全相同[10-12]，如日本希森美康XN-2000全自動血細胞分析儀檢測血小板有兩種方式，一種是基于于鞘流阻抗法的電阻抗法（PLT-I模式)，另一種則是基于流式細胞術(shù)、核酸熒光染色半導(dǎo)體激光法的光學(xué)法(PLTO模式)。而美國貝克曼庫爾特DXH800全自動血細胞分析儀則有所區(qū)別，其檢測血小板使用的原理為電阻抗法。在血小板數(shù)量大于100×10^9/L時系統(tǒng)將直方圖呈現(xiàn)為對數(shù)正態(tài)擬合曲線圖，并依據(jù)此圖分析得出最終的血小板數(shù)量，見圖4。當(dāng)樣本中的血小板數(shù)量小于20×10^9/L時，由于樣本中的血小板數(shù)量極少，儀器無法計數(shù)到有統(tǒng)計意義數(shù)量的血小板，因此所形成的直方圖是不規(guī)則的，見圖5。儀器無法對血小板直方圖進行擬合形成曲線，所得的血小板結(jié)果也就令人質(zhì)疑，需要依靠檢驗人員參照病人的疾病信息判斷儀器的結(jié)果是否可信。當(dāng)樣本中的血小板數(shù)量為20～100×10^9/L時，部分患者由于處于疾病狀態(tài)，體內(nèi)血小板的形態(tài)發(fā)生異常，其中一種異常類型為出現(xiàn)一定數(shù)量的大血小板，直徑為4～7μm，或者巨血小板，直徑常為7～20μm。在檢測此類樣本的血小板數(shù)量時，有一定數(shù)量的血小板可以通過儀器進行識別計數(shù)，形成血小板直方圖，并進行數(shù)字化分析擬合形成一條曲線，但是該曲線并不符合對數(shù)正態(tài)分布的規(guī)則，見圖6。從該圖和本實驗案例可知，當(dāng)血小板的體積大于25 fl時，儀器會有報警信息，所形成的血小板直方圖會產(chǎn)生尾部上翹的現(xiàn)象。

圖4 血小板直方圖圖示

圖5 血小板數(shù)量極少時的血小板直方圖圖示

圖6 存在大血小板或巨血小板時的血小板直方圖圖示

通過人工推片鏡檢計數(shù)進行對比后可發(fā)現(xiàn)，在排除細胞碎片、小紅細胞等干擾的情況下，儀器的血小板計數(shù)結(jié)果沒有將大血小板或巨血小板計數(shù)在內(nèi)，導(dǎo)致兩者之間存在一定的差異，鏡檢血小板計數(shù)結(jié)果更高。因此，在DXH800血液分析儀檢測分析出血小板計數(shù)結(jié)果低于100×10^9/L且直方圖出現(xiàn)異常尾部上翹的現(xiàn)象時，進行人工復(fù)檢修改血小板計數(shù)結(jié)果并備注有無大血小板或巨血小板存在是非常有必要的，有利于協(xié)助臨床醫(yī)生對患者病情進行更準(zhǔn)確的診斷。

急性排斥反應(yīng)作為排斥反應(yīng)的一種，是最常見的排斥反應(yīng)類型，多發(fā)生在移植術(shù)后早期，如不及時發(fā)現(xiàn)和處理，可導(dǎo)致移植物嚴重損害甚至失功。腎移植排斥反應(yīng)分為兩種，一種為移植腎組織間質(zhì)內(nèi)單個核炎性細胞浸潤，腎小管上皮炎和血管內(nèi)皮炎，另一種為移植腎實質(zhì)內(nèi)腎小球炎，動脈內(nèi)膜炎甚至動脈管壁纖維素樣壞死。因此，及時診斷AR是現(xiàn)階段保證移植物長期存活的重要環(huán)節(jié)。對同種異體移植手術(shù)后早期發(fā)現(xiàn)和治療AR的挑戰(zhàn)在于檢測和篩查移植物的排斥狀態(tài)。腎移植術(shù)后AR的發(fā)生是一種炎癥反應(yīng)過程。Banff病理分類方法強調(diào)，移植腎動脈內(nèi)膜炎是AR的基本病變[13]，而血小板的活化在移植腎動脈內(nèi)膜炎的炎癥反應(yīng)過程中扮演重要角色[14]。肝移植術(shù)后對AR的監(jiān)測，除了臨床觀察、生化及影像學(xué)檢查外，主要依據(jù)移植肝活檢組織病理，并采用Banff標(biāo)準(zhǔn)評分，評價方案主要觀察項目為：匯管區(qū)炎癥、膽管損傷、門靜脈或肝靜脈內(nèi)膜炎[15]。文獻表明，術(shù)前血小板計數(shù)小于49.5×10^9/L可能是肝移植受者不良預(yù)后的預(yù)測因素；血小板不僅參與止血和組織修復(fù)，還參與肝臟再生[16]。因此，血小板計數(shù)結(jié)果與臨床肝、腎移植術(shù)后患者病情轉(zhuǎn)歸及預(yù)后息息相關(guān)。

在AR的初始階段，活化的血小板產(chǎn)生各種細胞因子促進血小板與內(nèi)皮細胞黏附[17]。血小板分泌血栓素A2和二磷酸腺苷共同參與微血栓形成，后者是AR過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18]。除此之外，血小板活化后產(chǎn)生的鞘氨醇磷酸酯還可促進白細胞的活化和募集[19]。血小板活化釋放活化標(biāo)志物，AR發(fā)生時血小板活化標(biāo)志物水平升高，升高的血小板活化標(biāo)志物可被三磷酸核苷雙磷酸水解酶(NTPDasel)抑制[20-22]。當(dāng)血小板活化受到抑制后，其活化標(biāo)志物CD61、CD63、PAC-1、PDGF-BB和TGF-β等表達明顯減少，移植物功能趨于穩(wěn)定[23]。

當(dāng)機體因炎癥反應(yīng)出現(xiàn)血小板活化時，血小板（PLT)、血小板壓積（PCT)下降，平均血小板體積（MPV）、血小板體積分布寬度（PDW）、大血小板比率（P-LCR）增加，體積大和差異程度高的血小板含有更多的顆粒和更高的活性[17]。付紹杰[18]等的研究也發(fā)現(xiàn)MPV、PDW和P-LCR可作為提示腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)過程中血小板活化的重要指標(biāo)。近年有相關(guān)研究表明，腎移植功能延遲恢復(fù)作為腎移植患者常見并發(fā)癥之一，血小板五項參數(shù)中的PDW、MPV和P-LCR對其有較高的預(yù)測價值，早期監(jiān)測PDW、MPV和P-LCR對降低腎移植功能延遲恢復(fù)的發(fā)生率有重要意義[19-21]。

本文對病例的分析研究，與以上報道一致，驗證了大血小板具有作為輔助評估移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的潛在價值。通過對血液分析儀提供的血小板直方圖，初步判斷是否存在大血小板，利用手工推片進一步計算大血小板的數(shù)量，從而幫助臨床更加及時了解AR的進展?fàn)顩r，指導(dǎo)臨床使用抗AR藥物。在其他疾病或特殊生理狀態(tài)下，大血小板的生成也會增加，其中以妊娠、腫瘤以及心腦腎疾病多見，妊娠和惡性腫瘤所占比例最高[22]。在以上疾病中，大血小板增多都伴隨血小板的減少，因此可以初步推斷，大血小板為新生成的血小板，活性比正常血小板高，與疾病消耗破壞正常血小板有關(guān)。

綜上所述，使用BECKMAN COULTER DXH800全自動血細胞分析儀對腎移植或肝移植的患者進行血常規(guī)檢測時，應(yīng)對血小板減少且血小板直方圖異常的結(jié)果進行一定的重視，通過推片鏡檢的方式以確定是否存在大血小板，從而保證血常規(guī)檢驗結(jié)果的質(zhì)量，為臨床診斷排斥反應(yīng)提供一定的輔助作用。