杜琴，吳猛賢，施橋發(fā)，余曉君，劉發(fā)娣，柯江維

（1.江西省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2.江西省中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；3.南昌大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，江西 南昌 330006）

B群鏈球菌（group B streptococcus,GBS），又稱為無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae），是一種定植在人類下消化道及泌尿生殖道的細(xì)菌，健康人群帶菌率為15%～35%，是導(dǎo)致圍產(chǎn)期母親及新生兒嚴(yán)重感染的重要致病菌之一[1-2]。根據(jù)嬰兒GBS發(fā)病時(shí)間分為早發(fā)型（GBS-EOD）和晚 發(fā)型（GBS-LOD）。EOD是指感染發(fā)生在出生后6 d內(nèi)，晚發(fā)型為7 d至3個(gè)月內(nèi)，GBS侵襲性感染可引起新生兒或嬰兒肺炎、膿毒血癥、腦膜炎等，具有致殘率和病死率較高的特點(diǎn)[3]，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)GBS感染相關(guān)疾病負(fù)擔(dān)非常重視。我國(guó)大部分研究局限于孕產(chǎn)婦定植菌株的研究，嬰兒GBS侵襲性感染數(shù)據(jù)仍較缺乏。為了解本地區(qū)嬰兒GBS侵襲性感染菌株血清學(xué)分布特點(diǎn)及耐藥基因攜帶情況，特展開(kāi)此研究。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集江西省兒童醫(yī)院患兒無(wú)菌部位分離獲得的GBS菌株62株，納入標(biāo)準(zhǔn)為⑴發(fā)病年齡為0～1歲的嬰兒；⑵侵襲性GBS感染即無(wú)菌體液或組織分離培養(yǎng)GBS陽(yáng)性的病例；⑶診斷為血流感染及化膿性腦膜炎的患兒。剔除同一患兒不同時(shí)間段或不同標(biāo)本類型分離的相同生物學(xué)特征和相同藥敏試驗(yàn)結(jié)果的GBS菌株。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定與藥敏 患兒的血液、腦脊液等無(wú)菌體液標(biāo)本接種于BD兒童血培養(yǎng)瓶后放置血培養(yǎng)儀進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)后轉(zhuǎn)種至血平板，35℃、5%CO2培養(yǎng)18～24 h，通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察，phoneix-100全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定及抗菌藥物最低抑菌濃度檢測(cè)（MIC），藥敏結(jié)果參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室協(xié)會(huì)指南（CLSI-100）2021年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌（ATCC25923）。

1.3 誘導(dǎo)型克林霉素耐藥試驗(yàn) （D試驗(yàn)） 按照2021版CLSI-100采用雙紙片法對(duì)紅霉素耐藥、克林霉素敏感的GBS菌株進(jìn)行耐藥表型檢測(cè)。細(xì)菌對(duì)紅霉素和克林霉素均耐藥，即為結(jié)構(gòu)性耐藥表型（cMLSB）；若紅霉素耐藥，靠近紅霉素處克林霉素抑菌圈出現(xiàn)減少或截平，報(bào)告D試驗(yàn)陽(yáng)性，結(jié)果為紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥表型（iMLSB）；若對(duì)紅霉素耐藥而克林霉素抑菌圈無(wú)減少或截平，即M表型。若克林霉素耐藥而紅霉素敏感，即為L(zhǎng)型。

1.4 細(xì)菌DNA提取和PCR擴(kuò)增 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA。普通PCR方法檢測(cè)紅霉素耐藥基因ermA、ermB、mefA/E；克林霉素耐藥基因linB；四環(huán)素耐藥基因tetO、tetM、tetL、tetK及莢膜血清型cps基因，引物參考文獻(xiàn)[4-6]設(shè)計(jì)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠180 V電泳30 min后，Gel DOC凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行分析，兩組間的比較采用χ2檢驗(yàn)或fisher精確概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBS莢膜血清型分布62例GBS感染病例中早發(fā)型29例，晚發(fā)型33例。其中單純血培養(yǎng)陽(yáng)性40例，腦脊液培養(yǎng)陽(yáng)性9例，血和腦脊液同時(shí)檢出GBS菌株13例。62株GBS共檢出Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ、Ⅴ4種莢膜血清型，其中Ⅲ型32株（51.6%）為最常見(jiàn)血清型，其余依次為Ⅰb型21株（33.6%），Ⅰa型8株（12.9），Ⅴ型1株（1.6%）。GBS-EOD血清型分布依次為Ⅲ型13株（44.8%）、Ⅰb型12株（41.4%）、Ⅰa型3株（10.3%）、Ⅴ型1株(3.4%)；GBS-LOD血清型分布依次為Ⅲ型19株（57.6%）、Ⅰb型9株（27.3%）、Ⅰa型5株（15.2%）、早發(fā)型和晚發(fā)型血清型分布無(wú)顯著差異。22株腦脊液GBS菌株中Ⅲ型14株（63.6%）、Ⅰb型7株（31.8%）、Ⅰa型1株（4.5%）。

2.2 藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 62株GBS菌株對(duì)青霉素、頭孢噻肟、利奈唑胺、萬(wàn)古霉素均敏感；對(duì)紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星耐藥率為83.9%、80.6%、69.4%、17.7%。各血清型耐藥率，見(jiàn)表1。52株紅霉素耐藥菌株中cMLSB 49株；M型3株，未檢出iMLSB型;L耐藥表型檢出2株。紅霉素耐藥基因ermB檢出率最高約86.5%（45/52），44.2%菌株檢出mefA/E，ermB與mefA/E可單獨(dú)存在也可并存，3株M表型菌株均單獨(dú)攜帶mefA/E基因；未檢出ermA基因,linB基因檢出率32.0%。四環(huán)素耐藥基因以tetO和tetM為主，未檢出tetL和tetK。血清型與耐藥表型基因檢出類型具體，見(jiàn)表2。

表1 62株GBS耐藥性與血清分型相關(guān)性

表2 GBS不同血清型與紅霉素、四環(huán)素耐藥基因分布

3 討論

1970年GBS被發(fā)現(xiàn)可引起新生兒早發(fā)型感染，后期研究表明EOD最常見(jiàn)的發(fā)病機(jī)制是母體胃腸道和泌尿生殖道中存在的GBS在子宮腔的上升定植，感染發(fā)生于隨后的胎兒定植和或胎兒吸入感染的羊水[7]。這種發(fā)病機(jī)制主要發(fā)生在足月兒分娩期間，早產(chǎn)兒感染的時(shí)機(jī)不大確定，可能是胎膜早破和或早產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生[8]。GBS陽(yáng)性母親產(chǎn)下的新生兒大約50%存在B群鏈球菌定植，其中1%～2%將發(fā)展為GBS早發(fā)型[9]。20世紀(jì)90年代，發(fā)達(dá)國(guó)家推薦的GBS產(chǎn)前篩查及分娩期預(yù)防性使用抗菌藥物（IAP）,有效減低了新生兒GBS感染的發(fā)病率和病死率,德國(guó)研究數(shù)據(jù)[10]顯示GBS-EOD下降率大約為80%，EOD與LOD比例由80:20下降至60:40，美國(guó)GBS-EOD發(fā)病率由1.8每1000活產(chǎn)兒降至2015年0.23每1000活產(chǎn)兒，然而LOD卻無(wú)明顯下降趨勢(shì)[11]。LOD發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，有研究認(rèn)為部分LOD發(fā)生與母體內(nèi)GBS定植和母乳喂養(yǎng)有關(guān)[12]，IAP的實(shí)施可能降低母親體內(nèi)GBS定植密度,但是并沒(méi)有影響母體定植的狀態(tài)[13],大多數(shù)陽(yáng)性的產(chǎn)婦8周后仍然檢測(cè)到GBS重新定植[14]。也有學(xué)者認(rèn)為L(zhǎng)OD病例中母體并不普遍存在GBS定植，照料人的水平傳播同樣能引起嬰兒GBS感染[11]。目前普遍認(rèn)為通過(guò)在妊娠早期提供疫苗保護(hù)比任何產(chǎn)時(shí)的預(yù)防更加有效，它能夠提供一個(gè)長(zhǎng)期的更有效的免疫，即使在GBS-LOD感染也同樣有保護(hù)作用。迄今為止，作為GBS血清分型系統(tǒng)為基礎(chǔ)的含唾液酸的莢膜多糖（CPS）一直是大多數(shù)疫苗開(kāi)發(fā)的重要關(guān)健點(diǎn)。目前覆蓋五種血清型（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、V）的多價(jià)結(jié)合疫苗已經(jīng)在3期臨床試驗(yàn)階段[15]。

莢膜多糖抗原是GBS主要的毒力因子之一，根據(jù)莢膜多糖成分不同，可將GBS分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ-Ⅸ，共10種血清型。RUSSELL等學(xué)者對(duì)全球已發(fā)表的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行mete分析，結(jié)果顯示孕產(chǎn)婦定植血清型存在明顯的地域差異，如Ⅲ型血清型在亞洲分布較低，而VI、VII、VIII等少見(jiàn)的血清型更為常見(jiàn)；在非洲境內(nèi)，西非比其他地區(qū)更經(jīng)常報(bào)告V型[16]。SHABAYEK調(diào)查結(jié)果顯示，美國(guó)和歐洲存在的定植菌株主要為Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ和V血清型，IV和V分別在阿拉伯和埃及占主導(dǎo)地位，而VI和VIII型在日本孕婦中普遍流行[17]。我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)數(shù)據(jù)表明VI型為孕產(chǎn)婦主要定植型，而引起嬰兒侵襲性感染的菌株血清型以Ⅲ型為主，其次為Ⅰa型[18]。江西省婦幼保健院數(shù)據(jù)顯示孕產(chǎn)婦攜帶GBS血清型較多，以Ⅰb型和Ⅲ型為主，其次為Ⅰa、V、Ⅱ、IV和IX[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，嬰兒侵襲性菌株共四種血清型，依次為Ⅲ型51.6%、Ⅰb型33.6%、Ⅰa型10.3%、Ⅴ型3.4%；國(guó)內(nèi)林雅茵報(bào)道廈門地區(qū)患兒血清型分布依次為Ⅲ型59.0%、Ⅰa型15.7%、Ⅰb型14.5%、Ⅱ型4.8%、Ⅴ型3.6%[20]；中國(guó)嬰兒GBS感染多中心前瞻性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型（61.5%）和Ⅰb(28.7%)為主要血清型，其次為少量的Ⅰa（15.7%）、Ⅴ（7.0%）、IV和VI各(0.4%)及1例未定型，并且各地區(qū)血清學(xué)分布較相似，北部和東北部由血清型Ⅰb引起的比例高于其他地區(qū)[21]。Madrid認(rèn)為全球不同區(qū)域引起嬰兒患病的流行血清型是較相似的，僅有輕微的變化，以血清型Ⅲ為主導(dǎo)，Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和V型覆蓋97%的菌株[22]。嬰兒侵襲性菌株血清型可能更具有特點(diǎn)，與定植型GBS之間的血清學(xué)和遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)值得進(jìn)一步探討。

本研究顯示早發(fā)和晚發(fā)型均以血清型Ⅲ型最常見(jiàn)，占比約44.8%和57.6%。腦脊液標(biāo)本GBS菌株Ⅲ型約63.6%，與中國(guó)學(xué)者Ji研究數(shù)據(jù)[21]較接近，德國(guó)和意大利數(shù)據(jù)顯示80%以上的GBS化膿性腦膜炎由Ⅲ型血清型引起，并且Ⅲ型與LOD也存在明顯相關(guān)性[23-24]。血清Ⅲ型GBS比其他血清型更能引起侵襲性疾病，Ⅲ型多糖末端唾液酸殘基的存在抑制了補(bǔ)體替代途徑的激活，從而抑制了對(duì)GBS的吞噬作用[25-26]。

在中國(guó)廣泛使用紅霉素和克林霉素帶來(lái)的高耐藥率給青霉素過(guò)敏的患兒臨床用藥帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)，本研究GBS菌株對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥率分別為83.9%和82.6%。近期關(guān)于中國(guó)孕產(chǎn)婦的研究報(bào)道GBS對(duì)紅霉素和克林霉素的耐藥率72.0%、66.4%[27]，低于本研究。GBS菌株對(duì)紅霉素的主要耐藥機(jī)制是由erm基因介導(dǎo)的核糖體靶位點(diǎn)甲基化修飾，從而引起細(xì)菌MLSB交叉耐藥，此外，GBS對(duì)紅霉素的耐藥機(jī)制還包括mefA/E基因介導(dǎo)的外排作用，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)14.15元大環(huán)內(nèi)酯耐藥。本研究顯示GBS紅霉素耐藥株最主要的表型為cMSLB,主要由ermB和（或）mefA/E基因介導(dǎo)，與聶署萍和何其勵(lì)等研究相符[5-6]，在伊朗和韓國(guó),ermB和ermA/TR是大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的主要基因[28-29],ermA/TR主要介導(dǎo)iMLSB型耐藥[12]，本次尚未檢出。mefA/E基因介導(dǎo)的外排泵即使在紅霉素的存在下，并不能泵出克林霉素及林可內(nèi)酰胺類藥物，本實(shí)驗(yàn)中3株M型菌株均單獨(dú)攜帶mefA/E基因。血清型與耐藥表型及基因的相關(guān)性分析顯示，21株Ⅰb型均為cMLSB表型且均攜帶ermB和tetO基因；血清型Ⅰb型和Ⅲ型較Ⅰa型對(duì)紅霉素、克林霉素及四環(huán)素表現(xiàn)出較高的耐藥率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；全敏感菌株4株有3株為Ⅰa型。V型被報(bào)道具有獲得大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性[12]，但因檢出菌株檢出較少無(wú)法獲得比較數(shù)據(jù)。

綜上所述，引起嬰兒侵襲性感染的GBS菌株血清型分布較集中，以Ⅲ型最常見(jiàn)。本研究局限性在于菌株僅來(lái)源于江西省兒童醫(yī)院，樣本量較少，但研究對(duì)象為侵襲性感染患兒，血清學(xué)分布、耐藥性及基因的研究對(duì)疫苗的研發(fā)和推廣、臨床制定防治嬰兒GBS感染方案具有重要的指導(dǎo)價(jià)值，對(duì)預(yù)防和控制耐藥株的產(chǎn)生和傳播至關(guān)重要。