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        漢坦病毒核酸和IgM抗體檢測方法在腎綜合征出血熱早期實驗室診斷中的運用

        2021-04-06 09:10:56鄧志士劉佩佩雷錦輝劉師文龔甜熊英
        實驗與檢驗醫(yī)學(xué) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:膠體金核酸陽性率

        鄧志士,劉佩佩,雷錦輝,劉師文,龔甜,熊英

        (1.江西省高安市人民醫(yī)院,江西 高安 330800;2.江西省疾病預(yù)防控制中心,江西 南昌 330029)

        腎綜合征出血熱(HFRS)是由漢坦病毒引起的一種在東亞特別是中國流行的鼠傳疾病[1],全球病死率為1%~5%[2]。其發(fā)病機制可能是一個復(fù)雜的多因素過程,包括免疫反應(yīng)、血小板功能障礙和內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能失調(diào)[3]。發(fā)病早期采用有效的實驗室診斷方法提高診斷率對提高HFRS患者治愈率,降低病死率,減輕疾病負(fù)擔(dān)非常重要[4]。

        HFRS早期實驗室診斷傳統(tǒng)方法為血清特異性IgM抗體檢測[5],主要方法包括是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和膠體金法。然而IgM抗體檢測在早期臨床標(biāo)本應(yīng)用中顯示出較高的假陰性率,易漏診[6-7]。用隨著病毒核酸檢測技術(shù)的進步,不同類型的實時熒光PCR法在漢坦病毒檢測方面應(yīng)用也有報道[8-10],但是目前尚未見關(guān)于核酸檢測和IgM抗體檢測在HFRS早期病例診斷中的價值比較研究。

        本研究對93例HFRS疑似病例急性期血清標(biāo)本進行回顧性檢測分析,采用實時熒光RT-PCR法檢測漢坦病毒核酸,采用ELISA和膠體法檢測漢坦病毒IgM抗體,比較核酸檢測和血清學(xué)IgM檢測在HFRS早期病例診斷中的價值,為HFRS早期診斷提供更多依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 樣本來源 收集高安市人民醫(yī)院2020年5月至2021年5月HFRS疑似病例急性期血清標(biāo)本(發(fā)病至采樣≤7 d)93例,凍存于-70℃以下冰箱。疑似病例符合流行性出血熱診斷標(biāo)準(zhǔn)定義(WS278-2008)。

        1.2 試劑和儀器 漢坦病毒IgM抗體檢測試劑盒(北京萬泰)、核酸提取試劑(Qiagen)、核酸擴增試劑(Thermo fisher Scientific)、核酸提取儀(Qiagen,96)、熒光定量PCR儀(ABI,7500型)、酶標(biāo)儀(安圖斯,anthous 2010)。

        1.3 核酸檢測 采用核酸提取儀提取血清樣本核酸,采用雙重實時熒光RT-PCR檢測漢坦病毒核酸,具體參照文獻[11],該法最低檢出限為10 copies/μl。

        1.4 IgM抗體檢測 漢坦病毒IgM抗體檢測分別采用ELISA法和膠體金法,具體按照操作說明進行。

        1.5 統(tǒng)計分析 采用WPS表格記錄數(shù)據(jù),采用SPSS 22.0軟件按配對設(shè)計的卡方檢驗分析(Mc-Nemanr檢驗)進行統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,并用Kappa系數(shù)分析檢測結(jié)果的相關(guān)性。

        2 結(jié)果

        2.1 病例信息 高安市人民醫(yī)院是江西省HFRS監(jiān)測定點醫(yī)院。樣本和數(shù)據(jù)收集于高安市人民醫(yī)院傳染科病房,時間為2020年5月至2021年5月。按照《流行性出血熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》,共收集到93例疑似HFRS病例,男性51例,女性42例,年齡6~89歲(平均46.95歲),發(fā)病到血清采集時間為0~7 d,中位數(shù)4 d。

        2.2 核酸檢測結(jié)果 實時熒光RT-PCR法檢出漢坦病毒核酸陽性43例,陽性率46.24%,病毒型別均為漢灘型漢坦病毒。

        2.3 IgM抗體結(jié)果 93份血清標(biāo)本中ELISA法和膠體金法分別檢出檢出IgM陽性33例、32例,陽性率分別為:35.48%、34.41%,見表1。經(jīng)配對設(shè)計的卡方檢驗分析,兩種血清學(xué)方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1>0.05),Kappa值為0.976。

        表1 兩種血清學(xué)方法檢測IgM抗體符合率對比表

        2.4 核酸檢測與抗體結(jié)果比較 核酸檢測與ELISA結(jié)果比較,見表2。ELISA法和核酸檢測法檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.002<0.05)。Kappa值為0.780。兩種方法符合率89.25%(83/93)。以實時熒光RT-PCR法為標(biāo)準(zhǔn)[12],ELISA法靈敏度76.74%(33/43),特異度100%(50/50),陽性預(yù)測值100%(33/33),陰性預(yù)測值83.33%(50/60),準(zhǔn)確度89.25%(83/93)。

        表2 核酸檢測與ELIS法結(jié)果對比表

        核酸檢測與膠體金法結(jié)果比較,見表3。膠體金法與核酸檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001<0.05),Kappa值為0.758。兩種方法符合率88.17%(82/93)。以實時熒光RT-PCR法為標(biāo)準(zhǔn)[12],膠體金法靈敏度74.41%(32/43),特異度100%(50/50),陽性預(yù)測值100%(32/32),陰性預(yù)測值81.97%(50/61),準(zhǔn)確度88.17%(82/93)。

        表3 核酸檢測與膠體金法結(jié)果對比表

        2.5 血清抗體IgM和病毒核酸檢出情況與發(fā)病后血清采集時間關(guān)系 ELISA結(jié)合膠體金法共檢出IgM抗體陽性33份,血清抗體IgM和病毒核酸檢出情況與發(fā)病后采集時間關(guān)系,見圖1。10例IgM抗體陰性病毒核酸陽性標(biāo)本中6份發(fā)病至采樣時間≦3 d,平均3 d。

        圖1 血清IgM抗體和病毒核酸檢出情況與發(fā)病后血清采集時間比較圖

        3 討論

        HFRS的典型癥狀包括:發(fā)燒、頭痛、全身肌肉和腰痛等流感樣癥狀,以及厭食、惡心、嘔吐和腹瀉等胃腸道癥狀,最重要的是急性腎損傷。典型的HFRS分為五個階段:發(fā)熱、低血壓、少尿、多尿和恢復(fù)期[13]。典型癥狀臨床診斷難度不大,但是不典型HFRS病例非常多,尤其是兒童[14],對非典型癥狀和體征往往難以診斷,甚至誤診。據(jù)報道,HFRS可誤診為結(jié)石性膽囊炎、急性胰腺炎、膽管炎、闌尾炎、胃腸道出血[15]。因此,早期、快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù),對準(zhǔn)確判斷HFRS,及時開展有效治療,對降低危重比率和改善預(yù)后具有非常重要的意義[11]。

        HFRS潛伏期4 d~45 d,多為7 d~14 d,多數(shù)患者在發(fā)病初期就可能產(chǎn)生特異IgM抗體,ELISA法檢測漢坦病毒特異性IgM曾被認(rèn)為是診斷急性漢坦病毒感染最有價值和最廣泛使用的方法。本研究結(jié)果顯示以熒光RT-PCR法為標(biāo)準(zhǔn),ELISA法和膠體金法特異度均為100%,準(zhǔn)確度分別為89.25%、88.17%。93份樣本中膠體金法與ELISA法結(jié)果僅1例出現(xiàn)不一致,陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而膠體金法相對ELISA法操作更簡單,時間更短,不需要特殊儀器設(shè)備,據(jù)此推薦膠體金法檢測IgM抗體進行漢坦病毒感染快速篩查。

        由于個體差異或檢測方法的局限,常見抗體檢出率低[6],或患者首次IgM抗體陰性之后繼續(xù)采血檢測出現(xiàn)IgM陽性的報道[5,7]。馬有祥[16]研究報道IgM抗體檢測陽性率與病后血清采集時間有關(guān)系,在病人發(fā)病3 d以后IgM抗體檢測更具有實用價值。本研究中以實時熒光RT-PCR法為標(biāo)準(zhǔn),ELISA法靈敏度76.74%,膠體金法靈敏度74.41%。實時熒光RT-PCR法檢出陽性率高于ELISA法和膠體金法,該法靈敏、準(zhǔn)確、可對病毒分型,適用于HFRS早期病例實驗室診斷。10份IgM抗體陰性病毒核酸陽性標(biāo)本中,6份(60%)樣本病后血清采集時間≦3 d,提示發(fā)病后血清采集時間小于等于3 d的樣本進行IgM抗體檢測容易出現(xiàn)漏診。

        隨著病毒核酸檢測技術(shù)的進步,實時熒光RT-PCR技術(shù)因靈敏、特異、易于標(biāo)準(zhǔn)化的特點已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病毒分子診斷中。新冠疫情之后,基層核酸檢測能力大大提升,縣級以上的醫(yī)療結(jié)構(gòu)都已具備實時熒光RT-PCR檢測能力。

        因此我們建議醫(yī)療機構(gòu)運用實時熒光RTPCR法對疑似HFRS早期病例,尤其是發(fā)病3 d內(nèi)的病人進行實驗室診斷,提高實驗室診斷的陽性率,減少漏診,切實做到早診斷、早治療。

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