霍江華，倪倩，田沖沖，楊燁，盧小敏，俞黎黎，李長峰，錢炳俊

(1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005； 2.鹽城市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 鹽城 224005)

原發(fā)性高血壓是一種嚴(yán)重影響我國居民健康的多因素慢性疾病，也是導(dǎo)致我國居民心血管病死亡的主要原因，調(diào)查顯示我國年齡≥18歲居民的高血壓患病率為25.2%，患病人數(shù)多達2.7億，但目前其分子機制尚未完全清楚[1]。研究表明，微RNAs(microRNAs，miRNAs)可通過參與活化腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、促進血管平滑肌收縮、影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等途徑參與高血壓的發(fā)生發(fā)展[2]。研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)高血壓大鼠主動脈弓內(nèi)miR-150-5p的表達水平降低，而miR-150-5p表達水平的降低使轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白1(specific protein 1，SP1)及其下游基因血管緊張素Ⅱ1型受體的表達增加，從而導(dǎo)致自發(fā)高血壓大鼠的血壓升高；同時該研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗氧化表沒食子兒茶素沒食子酸酯能通過增加miR-150-5p的表達，降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓[3]?？梢?，miR-150-5p參與了血壓調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者循環(huán)血液中出現(xiàn)了多種miRNAs的表達改變，但有關(guān)高血壓患者循環(huán)miR-150-5p表達變化的人群研究較少，且結(jié)果并不一致[4-5]。本研究通過測定受試者循環(huán)miR-150-5p的表達水平，分析miR-150-5p表達與高血壓之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5—11月在鹽城市第一人民醫(yī)院住院的80例原發(fā)性高血壓患者作為高血壓組，符合《中國高血壓防治指南(2018年修訂版)》[6]中的原發(fā)性高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)[收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mmHg]，選擇同期31例非高血壓(收縮壓<140 mmHg和舒張壓<90 mmHg)患者作為非高血壓組。排除繼發(fā)性高血壓、有原發(fā)性腎臟疾病患者，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1信息收集及血樣采集 使用統(tǒng)一編制的調(diào)查問卷對兩組研究對象的一般狀況(性別、年齡等)和高血壓相關(guān)危險因素(吸煙、飲酒等)進行問卷調(diào)查，并測量受試者身高和體重，計算體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)。兩組研究對象均采集空腹靜脈血2份。一份測定空腹血糖、血紅蛋白、總蛋白、白蛋白、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血尿酸等生化指標(biāo)，并由臨床醫(yī)師按照糖尿病、高脂血癥、高尿酸血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)實驗室檢查結(jié)果做出相應(yīng)疾病的診斷；另一份用乙二胺四乙酸抗凝，3 000×g離心10 min，分離血漿并于-80 ℃儲存，留待進行miRNAs相對表達水平分析。

吸煙是指現(xiàn)在每日吸煙量超過1支，持續(xù)時間不少于1個月或過去曾經(jīng)吸煙；飲酒是指過去半年內(nèi)男性飲酒者日均酒精攝入量≥41 g，女性飲酒者日均酒精攝入量≥21 g[7-8]。糖尿病、高脂血癥、高尿酸血癥等疾病的診斷分別由臨床醫(yī)師按照《內(nèi)科學(xué)》第9版[9]相應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)進行判斷。①糖尿?。壕哂械湫偷呐R床癥狀加上任意血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L或葡萄糖負(fù)荷試驗2 h血糖≥11.1 mmol/L，沒有糖尿病典型臨床癥狀時必須重復(fù)檢測以確認(rèn)診斷[10]；②高脂血癥：血清中總膽固醇≥6.2 mmol/L或三酰甘油≥2.3 mmol/L或LDL-C≥4.1 mmol/L[9]；③高尿酸血癥：男性和絕經(jīng)后女性血尿酸>420 μmol/L、絕經(jīng)前女性>350 μmol/L[11]。

1.2.2血漿miRNAs提取 取200 μL血漿樣本置冰上融化后加入600 μL的Trizol LS(美國Invitrogen公司生產(chǎn)，批號：10296010)，室溫變性處理10 min，然后加入200 μL氯仿冰浴10 min后12 000×g離心15 min，取上層水相，加入兩倍體積無水乙醇，最后使用E.Z.N.A.?Micro RNA Kit(美國Omaga Biotek公司生產(chǎn)，批號：R6842-01)進行miRNAs的過柱純化[12]。

1.2.3miR-150-5p的實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)及靶基因預(yù)測 先用E.coli Poly(A) Polymerase[美國New England Biolabs(NEB)公司生產(chǎn)，批號：M0276]對純化的miRNAs進行加尾，以加尾后產(chǎn)物為模板按照the RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kits(美國Thermo Scientific公司生產(chǎn)，批號：K1622)說明書進行反轉(zhuǎn)錄。以通用引物和特異引物分別作為上下游引物，按照AceQ? qPCR SYBR Green Master Mix(南京Vazyme有限公司生產(chǎn)，批號：R223-01)試劑盒說明書測定miRNAs表達量。以U6為內(nèi)參，按公式Δct=Ct(miR) Ct(U6)計算Δct值，并用2-Δct計算miR-150-5p的相對表達水平(arbitrary units，AU)[4,12]。U6引物、通用引物和miR-150-5p的特異引物均為上海生工科技有限公司合成，其序列如下，U6正向引物：5′-CTCGC TTCGG CAGCA CAT-3′；U6反向引物：5′-AACGC TTCAC GAATT TGCGT-3′；通用引物5′-CAGTG CAGGG TCCGA GGT-3′；miR150-5p的特異引物(miR150-5p-F)：5′-CTCCC AACCCC TTGTA CCAGT-3′。利用starBase對miR-150-5p的靶基因進行在線預(yù)測，并用venny2.1在線繪圖軟件將miRDB、targetScan和miRTarBase三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到的靶基因求交集，最后利用starbase的通路分析功能對共同靶基因進行信號通路富集分析[13-14]。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者的一般情況比較 兩組患者的性別、年齡、血糖、血紅蛋白、總蛋白、白蛋白等生化指標(biāo)，以及吸煙、飲酒、合并癥等比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高血壓組的體重、BMI、收縮壓、舒張壓均高于非高血壓組(P<0.01)。見表1。

表1 高血壓組和非高血壓組患者一般情況比較

2.2miR-150-5p的表達 高血壓組血漿miR-150-5p的相對表達水平為2.33(1.96,3.29)×104AU，非高血壓組為5.46(3.98,7.01)×104AU，高血壓組血漿miR-150-5p的相對表達水平較非高血壓組降低57.33%(Z=-6.080，P<0.001，圖1a)。糖尿病組與非糖尿病組血漿miR-150-5p的相對表達水平分別為3.24(2.06,4.15)×104AU和2.74(2.07,4.60)×104AU，高脂血癥組與非高脂血癥組分別為2.32(1.91,3.38)×104AU和3.22(2.11,4.66)×104AU，高尿酸血癥與非高尿酸血癥組分別為2.48(1.87,3.84)×104AU和2.80(2.09,4.56)×104AU，比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.099，P=0.921；Z=-1.821，P=0.069；Z=-1.168，P=0.243)。見圖1b～d。按照BMI將所有受試者分為消瘦組(BMI<18.5 kg/m2)、正常組(kg/m218.5

圖1 不同疾病狀態(tài)下循環(huán)血漿miR-150-5p的相對表達水平比較

2.3miR-150-5p表達與血壓的相關(guān)性分析 采用Pearson積矩相關(guān)分析miR-150-5p相對表達水平與血壓的關(guān)系顯示，受試者血漿miR-150-5p的相對表達水平與其收縮壓、舒張壓均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.521、r=-0.503，均P<0.001)，見圖2。

miR:微RNA；1 mmHg=0.133 kPa

2.4miR-150-5p的靶基因預(yù)測結(jié)果 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，miR-150-5p可能結(jié)合的靶基因有17個，分別為SP1、鋅指E盒同源結(jié)合蛋白1、基質(zhì)金屬蛋白酶14、蛋白激酶Cα、VPS53、程序性細(xì)胞死亡因子4、EPH受體B2、核受體亞家族2 F組成員2、高爾基體SNAP受體復(fù)合物成員1、缺氧誘導(dǎo)的脂滴相關(guān)蛋白、鋅指和含BTB結(jié)構(gòu)域的蛋白7A、脂聯(lián)素受體2、Cbl原癌基因、腫瘤蛋白p53、E1A結(jié)合蛋白EP300、早期生長反應(yīng)蛋白2和轉(zhuǎn)錄因子原癌基因MYB(圖3)。除參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展外，這些靶基因也可以調(diào)控黏著斑信號通路、胰島素信號通路、促分裂原活化的蛋白激酶信號通路、Wnt信號通路、p53信號通路、凋亡信號通路和Notch信號通路等通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、凋亡和血管生成等過程(圖4)。

miR：微RNA

SNARE:可溶性NSF附著蛋白受體；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；MAPK：促分裂原活化的蛋白激酶；ERBB：酪氨酸激酶受體；miR：微RNA

3 討 論

miRNAs是由18～22個核苷酸構(gòu)成的非編碼單鏈RNA，成熟的miRNAs主要通過與目標(biāo)靶基因3′非翻譯區(qū)結(jié)合，誘導(dǎo)其降解或抑制其翻譯，參與心血管病發(fā)生發(fā)展的各個過程[15]。自2008年在腫瘤患者血漿和血清中被發(fā)現(xiàn)以來，循環(huán)miRNAs因其諸多優(yōu)點迅速成為疾病標(biāo)志物研究的熱點[16]?，F(xiàn)有研究表明，在高血壓患者血漿或血清中可檢測出多種miRNAs的表達改變，這些miRNAs的表達改變早于癥狀出現(xiàn)，不僅可作為潛在的高血壓疾病的分子標(biāo)志物，而且部分miRNAs的改變與靶器官損傷有關(guān)，可成為潛在的靶器官損傷分子標(biāo)志[17]。

miR-150-5p是一種在重度心力衰竭、缺血性腦卒中等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用的miRNAs，循環(huán)miR-150-5p的表達水平可以作為重度心力衰竭、缺血性腦卒中的生物標(biāo)志物[18-19]。Qian等[3]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，高血壓大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-150-5p表達下調(diào)，并證實miR-150-5p通過靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SP1，進一步上調(diào)高血壓大鼠胸主動脈中血管緊張素Ⅱ1型受體表達，介導(dǎo)腎素-血管緊張素系統(tǒng)參與高血壓的發(fā)展。雖然動物實驗已發(fā)現(xiàn)miR-150-5p基因敲除小鼠的收縮壓明顯增高，而升高miR-150-5p的表達水平又能夠降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[3,20]，但是目前有關(guān)循環(huán)miR-150-5p表達與高血壓關(guān)系的研究仍較少，且結(jié)果不一致。Karolina等[5]研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者循環(huán)血液中的miR-150-5p水平較血壓正常者降低；而Hijmans等[4]的研究卻得出了不同的結(jié)果，雖然高血壓患者循環(huán)血液中出現(xiàn)了多種miRNAs表達的顯著改變，如miR-21、miR-126、miR-146a和miR-34a等，但是miR-150-5p的表達水平卻僅稍有降低。本研究結(jié)果顯示，高血壓組血漿miR-150-5p的相對表達水平低于非高血壓組，且其相對表達水平與血壓呈負(fù)相關(guān)，提示循環(huán)miR-150-5p可能在高血壓發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。對高血壓引起miR-150-5p表達水平降低的機制進行研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素 Ⅱ 誘導(dǎo)的miR-150-5p宿主基因MIR150DNA甲基化可能是導(dǎo)致miR-150-5p水平下降的重要原因，應(yīng)用表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠減少MIR150基因的甲基化，增加miR-150-5p表達水平[21]。

miR-150-5p的目標(biāo)靶基因較多，這些基因不僅可通過調(diào)節(jié)下游基因表達經(jīng)多種途徑參與血壓調(diào)節(jié)，而且相互之間也存在復(fù)雜的調(diào)控機制。本研究結(jié)果顯示，miR-150-5p可能參與SP1、鋅指E盒同源結(jié)合蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)1、基質(zhì)金屬蛋白酶14、蛋白激酶Cα、VPS53、程序性細(xì)胞死亡因子4、EPH受體B2、核受體亞家族2 F組成員2、高爾基體SNAP受體復(fù)合物成員1、缺氧誘導(dǎo)的脂滴相關(guān)蛋白、鋅指和含BTB結(jié)構(gòu)域的蛋白7A、脂聯(lián)素受體2、Cbl原癌基因、腫瘤蛋白p53、E1A結(jié)合蛋白EP300、早期生長反應(yīng)蛋白2和轉(zhuǎn)錄因子原癌基因MYB基因的表達調(diào)控。其中，轉(zhuǎn)錄因子SP1在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，研究表明轉(zhuǎn)錄因子SP1不僅可以通過上調(diào)神經(jīng)纖毛蛋白1、神經(jīng)纖毛蛋白2和血管內(nèi)皮生長因子等基因的表達參與血管內(nèi)皮的生成分化，還能夠促進上皮細(xì)胞鈉通道α亞基、血管緊張素Ⅱ1型受體等基因表達，引起腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活，并能參與各種刺激作用下血管平滑肌細(xì)胞的增殖、生長和分化[22-23]。同時研究還發(fā)現(xiàn)，ZEB2和SP1之間存在正反饋調(diào)節(jié)，SP1能夠增加ZEB2的穩(wěn)定性，而ZEB2又能夠通過調(diào)節(jié)SP1的表達參與內(nèi)皮細(xì)胞的活化、血管生成等過程[24]。研究表明，miR-150-5p可以通過靶向負(fù)調(diào)控p53信使RNA的表達，進而影響血管內(nèi)皮生長因子和紅細(xì)胞生成素等血管生成相關(guān)蛋白的基因表達，從而參與血管生成過程的調(diào)節(jié)[25-26]。Liu等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-150過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠，下游靶向基因血清應(yīng)答因子表達下調(diào)，而血清應(yīng)答因子可通過調(diào)節(jié)miR-1、miR-133a和miR-21的表達水平發(fā)揮心肌保護作用；此外，miR-150可通過靶向作用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1保護低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞[28]。

綜上可知，miR-150-5p可能通過多種機制參與原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展，循環(huán)血漿中miR-150-5p的表達水平與血壓呈負(fù)相關(guān)，可能成為高血壓疾病診斷的新型標(biāo)志物。但是miR-150-5p參與血壓調(diào)節(jié)的機制較復(fù)雜，尚需進一步的試驗研究。