王永超，謝斌，王東凱

(1.沈陽藥科大學藥學院，沈陽 110016；2.珠海潤都制藥股份有限公司，珠海 519041)

單硝酸異山梨酯作用機制是釋放一氧化氮，松弛血管平滑肌，降低心臟前后負荷，減少心肌耗氧量。臨床上主要用于冠心病、心絞痛等心血管疾病[1-3]。本研究通過中國健康受試者空腹和餐后口服珠海潤都制藥股份有限公司生產的單硝酸異山梨酯緩釋膠囊(受試制劑)與原研藥品(商品名：Elantan?，參比制劑)，評價受試制劑與參比制劑生物等效性的可能性[4]。

1 試藥與儀器

1.1試藥 受試制劑：單硝酸異山梨酯緩釋膠囊，規(guī)格：50 mg，批號：20180301，珠海潤都制藥股份有限公司生產；參比制劑：單硝酸異山梨酯緩釋膠囊(商品名：Elantan?)，規(guī)格：50 mg，批號：9717503，Aesica Pharmaceuticals GmbH/Germany(持證商：UCB Pharma)生產。單硝酸異山梨酯對照品，含量：99.9%，批號：1029-206A1，由加拿大TLC公司提供；單硝酸異山梨酯-13C6(內標)，含量：99.8%，批號：1110-095A1，由加拿大TLC公司提供。

1.2儀器 Triple Quad 6500 plus質譜儀、Analyst 1.6.3分析軟件均為AB Sciex公司產品；LC-20AD XR 高效液相色譜儀，Shimadzu公司；藥動學分析采用Phoenix WinNonlin 軟件(8.1版本)，描述性統(tǒng)計分析采用SAS 軟件(9.4版本)。

2 方法與結果

2.1研究對象 本研究通過北京市房山區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書?？崭乖囼灪Y選198例，入組28例，完成試驗28例，其中男17例，女11例，年齡為(34.8±8.36)歲，體質量為(61.3±8.72)kg，身高為(165.9±8.04)cm，體質量指數(shù)為(22.2±1.66)kg·(m2)-1；餐后試驗篩選197例，入組28例，完成試驗28例，其中男18例，女10例，年齡為(29.8±6.99)歲，體質量為(66.3±7.30)kg，身高為(168.4±6.98)cm，體質量指數(shù)為(23.3±1.58)kg·(m2)-1。

經詢問無心血管(如心肌炎和冠心病)、肝、腎、內分泌、消化、代謝紊亂、青光眼等病史，無藥物過敏史及濫用史，無煙酒嗜好，試驗前2周未服用其他藥物，實驗室檢查(血常規(guī)、血生化、尿常規(guī)、血清學)及心電圖檢查均正常或異常無臨床意義，女性受試者妊娠檢查正常，尿液藥物濫用篩查、乙醇呼氣檢查、煙檢均為陰性。受試者試驗期間統(tǒng)一飲食，禁止劇烈活動等。

2.2給藥方案與血樣采集 本研究分別進行單次空腹和餐后用藥，兩制劑、兩周期、兩序列、隨機、開放、兩周期、自身交叉的平均生物等效性研究，清洗期為7 d。

受試者于每周期給藥前一晚入?、衿谂R床試驗病房，禁食10 h?？崭菇M于清晨空腹狀態(tài)下，口服由研究人員發(fā)放的受試制劑或參比制劑50 mg，用溫水240 mL送服。餐后組于8：00進食高脂高熱餐，30 min內進食完畢。受試者在給開始用餐后30 min時，口服由研究人員發(fā)放的受試制劑或參比制劑50 mg，用溫水240 mL送服。受試者用藥前1 h至用藥后1h禁止飲水，用藥后保持上身直立狀態(tài)2 h。用藥后4和10 h進食午餐和晚餐。

空腹組每周期共需采集23管靜脈血(每管3 mL)，分別在給藥0 h(給藥前60 min內)和給藥后0.083，0.167，0.25，0.5，0.75，1，2，3，4，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，9，10，12，15，24和36 h，由前臂靜脈采血3 mL。餐后組每周期共需采集23管靜脈血(每管3 mL)，分別在給藥0 h(給藥前60 min內)和給藥后0.5，1，2，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，12，15，24和36 h，由前臂靜脈采血3 mL。7 d后交叉給藥，相同時間點取血。

將血液采集至已標記好的含有EDTA-K2抗凝劑的真空采血管中。若使用靜脈留置針采血，每次采血前棄去血液混合物約1 mL，每次采血后用適量肝素鈉溶液進行封管。

生物樣品采集后需轉運至樣本預處理室，于1.5 h內離心，1 700×g4 ℃離心10 min后分離血漿樣本，抽取上層血漿分為兩份轉移至貼有標簽的凍存管中，其中一份(≤1 mL)用于血樣分析，另一份(≤1 mL)作為備份。離心后2 h內可將血漿樣本置于-10～-30 ℃冰箱中暫存，并在24 h內轉移至-60～-90 ℃超低溫冰箱中保存，也可以直接置于-60～-90 ℃超低溫冰箱保存。

2.3方法學考察與評價

2.3.1色譜條件 色譜柱：Ultimate XB C18(2.1 mm×50.0 mm，5.0 μm)；流動相A：含5 mmol·L-1乙酸銨溶液；流動相B：乙腈溶液；總流速：0.700 mL·min-1；梯度洗脫：0～0.1 min 10%B，>0.1～1.7 min 10%→90%B，>1.7～2.4 min 90%B，>2.4～2.5 min 90%→10%B，>2.5～3.2min 10%B；柱溫：30 ℃；進樣量：20.0 μL。

2.3.2質譜條件 離子源：ESI；離子化方式：負離子模式；掃描方式：MRM；MRM離子對：單硝酸異山梨酯250.1→59.1，單硝酸異山梨酯-13C6256.1→59.1。

2.3.3血漿樣品處理 精密轉移血漿樣品80.0 μL至96孔板中，加入內標工作溶液(濃度為600 ng·mL-1)25.0 μL，加入乙酸乙酯800 μL，渦旋混合，在4 ℃ 1 700×g離心15 min；轉移有機相500 μL至另一塊96孔板中，由氮氣吹干后加入乙腈：水(10：90)150 μL，渦旋混合5 min，取20.0 μL進樣，進行LC-MS/MS分析，并記錄色譜圖。

2.3.4系統(tǒng)適用性 系統(tǒng)適用性評價樣品為6個系統(tǒng)適用性定量下限樣品，在每個分析批開始進樣前均進行系統(tǒng)適用性評價測試，以確認該儀器狀態(tài)。結果顯示分析物保留時間的RSD≤0.9%，內標保留時間的RSD≤0.6%，分析物與內標峰面積比的RSD≤12.7%，表明系統(tǒng)適用性良好。

2.3.5選擇性 不同來源的空白基質對分析物均無干擾；混合來源的空白基質、空白試劑溶液對分析物和內標的檢測無干擾；內標對分析物、分析物對內標的檢測無干擾，均符合接受標準。

2.3.6標準曲線與定量下限 在1.5 mL聚丙烯離心管中，用移液器加入適量空白人正常血漿。加入相應的源溶液，渦旋混勻(約30 s)，配制成相應的校正標樣(5.00，10.0，20.0，50.0，200，500，900，1000 ng·mL-1)。按樣本處理操作，以分析物(單硝酸異山梨酯)與內標(單硝酸異山梨酯-13C6)的色譜峰面積比對分析物濃度(權重1/X2)進行線性回歸，得回歸方程Y=0.005 09X+0.000 292，線性擬合度R2為0.997 0，線性范圍為5.00～1 000 ng·mL-1，定量下限5.00 ng·mL-1。

2.3.7殘留效應 在最高濃度的校正標樣后連續(xù)分析兩個空白基質樣品來評價殘留效應。在分析物保留時間處干擾峰的響應均低于定量下限中分析物響應的20%，內標保留時間處干擾峰的響應均低于零濃度樣品中內標響應的5%。結果表明，最高濃度后面的2個空白基質樣品均無峰面積，分析物與內標均無殘留效應，不影響定量。

2.3.8基質效應 精密吸取單硝酸異山梨酯工作溶液和內標溶液，用乙腈-水(10：90)稀釋，分別配制成分析物濃度為250，33.3，5.00 ng·mL-1，內標濃度均為62.5 ng·mL-1的3種濃度的純溶液。含基質樣品：精密移取血漿樣品80.0 μL至96孔板中，加入內標工作溶液(濃度為600 ng·mL-1)25.0 μL，再加入乙酸乙酯800 μL，渦旋混合，在4 ℃ 1 700×g離心15 min；轉移有機相500 μL至另一塊96孔板中，由氮氣吹干后加入上述3種純溶液，渦旋混合5 min，取20.0 μL進樣，每個濃度采用6個不同來源的基質配制平行樣1個。不含基質樣品：精密移取空白試劑80.0 μL至96孔板中，加入甲醇：水(50：50)25.0 μL，再加入乙酸乙酯800 μL，渦旋混合，在4 ℃ 1 700×g離心15 min；轉移有機相500 μL至另一塊96孔板中，由氮氣吹干后加入上述3種純溶液，渦旋混合5 min，取20.0 μL進樣，每個濃度配制平行樣3個。采用基質存在下的峰面積與不含基質的相應峰面積的比值分別計算分析物和內標的基質因子，對基質效應進行評價。內標歸一化的基質因子其值越接近1，說明內標與分析物的基質效應越接近，基質效應不影響最終的準確定量分析。實驗結果顯示，低、中、高濃度的內標歸一化的基質因子分別為1.03，0.981，1.02，RSD分別為3.1%，2.9%，2.6%，表明無明顯基質效應。

2.3.9精密度與準確度 配制定量下限、低、中和高4個濃度的質控樣品(分別為5.00，15.00，100，750 ng·mL-1)，按血漿樣本處理操作，在3個分析批中，各濃度質控樣品均配制平行樣6個，評價本方法的精密度與準確度，結果見表1。

表1 人血漿中單硝酸異山梨酯含量測定的方法精度和準確度

2.3.10回收率 按血漿樣本處理操作，最后不加入乙腈：水(10：90)150 μL，加入相應純溶液，測定采用正常空白血漿(高脂空白血漿)配制成低、中、高濃度的質控樣中分析物和內標峰面積，以及各濃度回收率評價中分析物和內標峰面積，計算回收率。結果見表2。

表2 人血漿中單硝酸異山梨酯含量測定的方法回收率

2.3.11穩(wěn)定性 分別考察全血中分析物在室溫(RSD≤2.3%)和濕冰(RSD≤5.8%)條件下放置2 h穩(wěn)定性；血漿中分析物在室溫下放置24 h穩(wěn)定性(RSD≤6.3%)；處理過的樣品在自動進樣器(4 ℃)下存儲72 h穩(wěn)定性(RSD≤5.4%)；血漿中分析物經過5次冷凍和融化循環(huán)后穩(wěn)定性(RSD≤5.5%)；血漿中分析物儲存在-15～35 ℃條件下29d穩(wěn)定性(RSD≤4.2%)，在-60～90 ℃條件下65 d穩(wěn)定性(RSD≤2.5%)。結果表明單硝酸異山梨酯的血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.4血藥濃度-時間曲線 空腹和餐后條件下各有28例健康受試者單劑量口服受試制劑和參比制劑，單硝酸異山梨酯血藥濃度-時間曲線見圖1。

圖1 空腹(A)和餐后(B)口服受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度-時間曲線

2.5藥動學參數(shù) 經WinNonlin 8.1版軟件計算健康受試者空腹或餐后口服受試制劑和參比制劑后的藥動學參數(shù)，見表3。采用非參數(shù)檢驗(Wilcoxon符號秩檢驗)評價受試制劑和參比制劑峰時間(tmax)的差異。

表3 健康受試者空腹或餐后條件下單次口服單硝酸異山梨酯緩釋膠囊后PK參數(shù)

2.6生物等效性分析 將對數(shù)轉換后的受試制劑和參比制劑的藥動學參數(shù)峰濃度(Cmax)、血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0-t)、AUC0-∞進行方差分析，采用雙向單側t檢驗及(1-2α)置信區(qū)間(CI)法進行生物等效性評價，其中tmax采用非參數(shù)法(Wilcoxon符號秩檢驗)檢驗。結果表明，空腹試驗中Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的90%置信區(qū)間分別為(99.91，105.55)%，(98.85，103.54)%，(98.89，103.70)%；餐后試驗中Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的90%CI分別為(88.54，97.23)%，(95.21，99.48)%，(95.12，99.55)%。因此無論是在空腹還是餐后條件下，受試制劑與參比制劑的主要藥代動力學參數(shù)Cmax、AUC0-t、AUC0-∞幾何均數(shù)比值的90%置信區(qū)間均在80.00%～125.00%范圍內，滿足判定標準，表明空腹和餐后條件下口服受試制劑和參比制劑具有生物等效。

2.7安全性評價 空腹試驗，不良事件主要包括頭痛、頭暈、血壓降低等。共發(fā)生不良事件的例次為127，例數(shù)為27，發(fā)生率為96.4%，均為輕度。服用受試好。制劑階段例次為60，例數(shù)為26，發(fā)生率為92.9%；服用參比制劑階段例次為67，例數(shù)為26，發(fā)生率為92.9%；均無導致退出試驗的不良事件發(fā)生，無嚴重不良事件發(fā)生。

餐后試驗，不良事件主要包括頭痛、頭暈、血壓降低、嘔吐等。共發(fā)生不良事件的例次為169，例數(shù)為28，發(fā)生率為100.0%，嚴重程度均為輕度。服用受試制劑階段例次為76，例數(shù)為26，發(fā)生率為92.9%；服用參比制劑階段例次為93，例數(shù)為27，發(fā)生率為96.4%；均無導致退出試驗的不良事件發(fā)生，無嚴重不良事件發(fā)生。

試驗數(shù)據(jù)表明，健康受試者空腹和餐后條件下單次服用單硝酸異山梨酯緩釋膠囊受試制劑和參比制劑后不良事件發(fā)生率基本一致，可認為受試制劑和參比制劑在健康成年受試者中安全性相當，耐受性良好。

3 討論

本項研究中健康成年受試者在空腹條件或餐后條件下單次口服50 mg單硝酸異山梨酯緩釋膠囊參比制劑和受試制劑后，血漿中單硝酸異山梨酯經對數(shù)轉換的Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的90%CI在生物等效性評價接受的(80.00%，125.00%)范圍內，基于臨床試驗數(shù)據(jù)可以判斷，受試制劑與參比制劑在吸收速度及吸收程度上均無顯著性差異，兩制劑等效。