趙常紅，李世昌，孫 朋，劉 媛，胡曉磐，徐 帥

軟骨細(xì)胞是一種特異性骨骼細(xì)胞。生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的肥大是骨縱向生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，軟骨細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extraceellular matrix，ECM）的基礎(chǔ)。生長(zhǎng)板的軟骨細(xì)胞分為增殖層、肥大層，軟骨細(xì)胞基本成列整齊排列，有序地進(jìn)行增殖肥大，負(fù)責(zé)長(zhǎng)骨的縱向生長(zhǎng)（Sun et al.，2014）。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（transforming growth factor β，TGFβ）作為調(diào)控軟骨細(xì)胞分化與成熟的重要途徑，在關(guān)節(jié)軟骨的形成、軟骨特性的維持和生長(zhǎng)板軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)TGFβ是一種有效的體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchyma stem cell，MSC）成軟骨細(xì)胞的分化劑（Wu et al.，2016），MSC聚集后，TGFβ信號(hào)進(jìn)一步刺激軟骨細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制軟骨細(xì)胞肥大和成熟（Song et al.，2007）。相反，BMP/Smad1、Smad5、Smad8通路的活化刺激肥大化標(biāo)記Col10的表達(dá)，但隨之刺激MMP13（Hellingman et al.，2011）。TGFβ抑制軟骨細(xì)胞終末肥大分化，通過(guò)Smad2/3維持正常軟骨（Studer et al.，2012）。縱向骨生長(zhǎng)只發(fā)生在軟骨，TGFβ1在人類已被證明可調(diào)控軟骨細(xì)胞肥大化（Narcisi et al.，2012），調(diào)節(jié)生長(zhǎng)板軟骨內(nèi)骨化過(guò)程實(shí)現(xiàn)，特別是在軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中有維持靜息層軟骨細(xì)胞特性的作用（Kronenberg，2003；Yeung et al.，2014）。通過(guò)不同方式的運(yùn)動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)TGFβ/BMP信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)生長(zhǎng)板增殖肥大影響骨縱向生長(zhǎng)的研究目前鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用不同方式的運(yùn)動(dòng)，如非負(fù)重運(yùn)動(dòng)（如游泳）、自負(fù)重運(yùn)動(dòng)（如跑步）和超自重運(yùn)動(dòng)（如跳躍練習(xí)）的方式，比較生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞肥大產(chǎn)生的變化，從骨組織生長(zhǎng)的表型、細(xì)胞和細(xì)胞因子3個(gè)層面進(jìn)行求證闡述。兒童青春期是身高增加的關(guān)鍵時(shí)期，而且SD大鼠作為研究生長(zhǎng)板的動(dòng)物模型，4周的SD大鼠相當(dāng)于人的兒童期，12周相當(dāng)于人的青春期后期（Andreollo et al.，2012），所以本實(shí)驗(yàn)以4周齡的SD大鼠3周適應(yīng)性訓(xùn)練開始，運(yùn)動(dòng)6周后處理、取材，相當(dāng)于青春期快結(jié)束基本成年階段，身高基本定型。在這個(gè)年齡段研究不同的方式運(yùn)動(dòng)對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞及細(xì)胞因子的影響，探究不同方式的運(yùn)動(dòng)如何通過(guò)TGFβ/BMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)兒童青少年生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞，最終影響骨縱向生長(zhǎng)的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究采用4周齡48只清潔級(jí)SD大鼠（雄性）作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，全部購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。隨機(jī)分成4組，每組12只，即對(duì)照組（control group）、游泳組（swimming group）、跑臺(tái)組（running group）和下跳組（down jump group），以下分別簡(jiǎn)稱C組、S組、R組、D組。各組分籠飼養(yǎng)，每天訓(xùn)練結(jié)束后添加飼料并更換飲用水，定期更換墊料、鼠籠，以保持大鼠飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生、清潔，相對(duì)濕度為50%～55%，溫度為（24±3）℃。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

對(duì)照組（C組）：正常飼養(yǎng)，但不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)干預(yù)。游泳組（S組）：游泳訓(xùn)練池大小為50×60×50（長(zhǎng)×寬×高，cm），水深40 cm，水溫（20±2）℃。大鼠前3天游泳運(yùn)動(dòng)18 min/天，以后第1周游泳運(yùn)動(dòng)30 min/天，第2周開始每天游泳運(yùn)動(dòng)50 min，第3周開始每天游泳運(yùn)動(dòng)60 min，每周訓(xùn)練6天。跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組（R組）：大鼠前3天跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)18 min/天，以后第1周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)30 min/天，第2周開始每天跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)50 min，第3周開始每天跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)60 min，每周訓(xùn)練6天，跑速為1.2 Km/h，跑臺(tái)坡度為0°。下跳運(yùn)動(dòng)組（D）：前3天跳躍運(yùn)動(dòng)18 min/天，以后第1周天跳躍運(yùn)動(dòng)30 min/天，第2周開始每天跳躍運(yùn)動(dòng)50 min，第3周開始每天跳躍運(yùn)動(dòng)60 min，每周訓(xùn)練6天，下跳高度為20 cm，頻率為7～8次/min。對(duì)于4周齡的SD大鼠，游泳60 min左右會(huì)容易導(dǎo)致其力竭沉入水底溺死，60 min（20 m/min）的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)屬于高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，60 min下跳運(yùn)動(dòng)（高度為20 cm，頻率為7～8次/min）也屬于高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，隨著3天的適應(yīng)性訓(xùn)練和第1周30 min、第2周50 min的訓(xùn)練，大鼠年齡增至6周，到訓(xùn)練結(jié)束時(shí)各組大概達(dá)到此年齡階段的中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度（李良等，2018；許杰等，2018；Flores et al.，2006）。6周的訓(xùn)練結(jié)束后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

取各組大鼠后左肢骨（去軟組織），放置PBS，用4%多聚甲醛固定，然后脫鈣4周，脫鈣后進(jìn)行石蠟包埋、切片，然后進(jìn)行HE染色，檢測(cè)軟骨細(xì)胞數(shù)量及分布，顯示生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的組織形態(tài)，用IPP測(cè)量生長(zhǎng)板靜息層、增殖層、肥大層及生長(zhǎng)板的總厚度及各層百分比。

1.4 脛骨和股骨的長(zhǎng)度和圍度指標(biāo)測(cè)試

訓(xùn)練結(jié)束后，將各組大鼠立即處死，取后肢脛骨和股骨，并左右分開，將肌肉和其他韌帶組織剝離干凈，并用電子秤進(jìn)行稱重，用游標(biāo)卡尺測(cè)量脛骨和股骨的長(zhǎng)骨和最細(xì)部位矢狀面的厚度，進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 HE染色

將各組大鼠處死，在股骨頭關(guān)節(jié)處脫臼取下其左側(cè)后肢骨，剔除干凈股骨和脛骨上附著的肌肉和韌帶。然后浸入PBS中清洗2遍干凈后，放置在4% PFA（50 mL EP管）溶液中，4℃冰箱固定過(guò)夜。然后再將10% EDTA溶液加入EP管中，進(jìn)行20天的脫鈣處理后進(jìn)行石蠟包埋，切片。將石蠟切片在烤片機(jī)上（62℃）烤干（2～3 h）。二甲苯 II、二甲苯 I透明各 5 min，100%、95%、85%、75%、50%酒精復(fù)水各2 min，蘇木精染色30 s。流水清洗2 min或觀測(cè)沖洗的水變得無(wú)色即可，將切片放入染缸中，將染缸置于水龍頭下，用流水清洗其中的切片。將切片浸入1%鹽酸＋70%乙醇（1 mL濃鹽酸＋99 mL 70%乙醇）分色2～5 s（直到顏色變成粉色），以鏡檢為準(zhǔn)，再用水洗一遍。將切片緩慢放入氨水（1 mL氨水＋1 L水的比例）返藍(lán)3～5 s，再將浸入伊紅染15～30 s，自來(lái)水清洗切片。接著100%酒精2 min，100%酒精2 min，95%酒精2 min，二甲苯I、II透明各5 min，中性樹膠封片過(guò)夜。然后在顯微鏡下拍片保存。利用Image pro plus 6.0軟件進(jìn)行標(biāo)尺校正后進(jìn)行測(cè)量。

1.6 生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中相關(guān)細(xì)胞因子mRNA和蛋白檢測(cè)

取生長(zhǎng)板軟骨放入液氮預(yù)冷過(guò)的研缽中進(jìn)行研磨，提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR熒光定量對(duì)TGFβ/BMP信號(hào)及下游基因進(jìn)行檢測(cè)，引物由Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)（表1），由博尚生物科技有限公司合成。蛋白提取加裂解液研磨，然后移入EP管中冰上放15 min，4℃離心10 min，取上清，加入等體積loading buffer 100℃解構(gòu)，加樣，待loading buffer跑至底部，切膠轉(zhuǎn)膜，待轉(zhuǎn)好后用麗春紅染帶，用PBS洗3遍，剪膜標(biāo)記目的蛋白，放入暗盒用5%的脫脂奶粉封閉1 h，然后加入目的蛋白一抗4℃過(guò)夜，用PBST洗5 min/3遍，加入相應(yīng)的二抗2 h，再用PBST洗15 min/3遍，最后掃膜，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析?？贵w分別購(gòu)于abcam和CST公司。

表1 引物序列Table 1 List of Primer Sequences

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010和IBM SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，所有數(shù)據(jù)均用M±SD（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，統(tǒng)計(jì)分析均采用單因素ANOVA方差分析。*表示與C組比較，P＜0.05有顯著性差異，**表示P＜0.01，有非常顯著性差異；#表示與S組比較，P＜0.05有顯著性差異，##表示P＜0.01，有非常顯著性差異；&表示與R組比較，P＜0.05有顯著性差異，&&表示P＜0.01，有非常顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同方式運(yùn)動(dòng)后生長(zhǎng)期大鼠后肢長(zhǎng)度、圍度比較

本研究發(fā)現(xiàn)（圖1，表2），脛骨長(zhǎng)度與C組和S組相比，R組和D組都非常顯著性增加（P＜0.01）；股骨長(zhǎng)度與C組和S組相比，R組和D組都非常顯著性增加（P＜0.01）。

圖1 不同方式運(yùn)動(dòng)后大鼠脛骨、股骨長(zhǎng)度和圍度指標(biāo)示意圖Figure 1. ASketch Map of the Length and Dimension of the Tibia and Femur of Rats after Different Ways of Exercise

表2 不同方式運(yùn)動(dòng)后大鼠脛骨、股骨長(zhǎng)度和圍度比較Table 2 Comparison of Length and Dimension of Tibia and Femur in Rats after Different Ways of Exercise n=12

2.2 不同方式運(yùn)動(dòng)后生長(zhǎng)期大鼠生長(zhǎng)板寬度比較

本研究發(fā)現(xiàn)，不同方式運(yùn)動(dòng)后，組間生長(zhǎng)板的靜息層寬度無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；增殖層寬度也無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；肥大層寬度只有D組與C組和S組相比，有非常顯著性增加（P＜0.01），R組雖有增加趨勢(shì)但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；生長(zhǎng)板的總寬度組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。靜息層占生長(zhǎng)板總寬度百分比與C組比較，S組無(wú)差異性，與C組和S組相比，R組和D組均非常顯著性下降（P＜0.01）；增殖層占生長(zhǎng)板總寬度百分比組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；生長(zhǎng)板的肥大層占生長(zhǎng)板總寬度百分比與C組比較，S組無(wú)差異，與C組和S組相比，R組和D組都非常顯著性增加（P＜0.01，表3）。

圖2 不同方式運(yùn)動(dòng)后大鼠生長(zhǎng)板各層寬度指標(biāo)比較Figure 2. The Comparison of the Width Index of Each Layer of the Growth Plate of Rats after Different Ways of Exercise

表3 不同方式運(yùn)動(dòng)后大鼠生長(zhǎng)板各層寬度指標(biāo)比較Table 3 Comparison of the Width Index of Each Layer of Rat Growth Plate after Different Ways of Exercise n=6

2.3 不同方式運(yùn)動(dòng)后生長(zhǎng)期大鼠生長(zhǎng)板肥大細(xì)胞數(shù)比較

與C組相比，S組的生長(zhǎng)板肥大軟骨細(xì)胞無(wú)顯著性差異（P＞0.05），R組顯著性增加（P＜0.05），D組非常顯著性增加（P＜0.01）。與S組相比，R組和D組的都非常顯著性增加（P＜0.01，圖3，表4）。

表4 不同方式運(yùn)動(dòng)后大鼠生長(zhǎng)板肥大軟骨細(xì)胞數(shù)比較Table 4 Comparison of the Number of Hypertrophic Chondrocytes in the Growth Plate of Rats after Different Ways of Exercise n=6

2.4 不同方式運(yùn)動(dòng)對(duì)TGFβ/BMP信號(hào)通路的影響

2.4.1 不同方式運(yùn)動(dòng)后TGFβ/BMP信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)比較

本研究發(fā)現(xiàn)，BMP2 mRNA的表達(dá)水平與C組相比，S組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），R組和D組都非常顯著性上調(diào)（P＜0.01），D組與R組相比，也顯著性上調(diào)（P＜0.05）；Smad1 mRNA的表達(dá)水平只有D組與C組和S組相比顯著性上調(diào)（P＜0.05）；Smad5 mRNA的表達(dá)水平與C組相比，S組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），R組和D組都顯著性上調(diào)（P＜0.05）；Smad8 mRNA的表達(dá)水平與C組相比，S組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），R組和D組都非常顯著性上調(diào)（P＜0.01）；TGFβ1 mRNA的表達(dá)水平與C組相比，S組的無(wú)顯著性差異（P＞0.05），R組和D組都非常顯著性下降（P＜0.01），與S組相比，R組和D組的顯著性下降（P＜0.05）；Smad2 mRNA的表達(dá)水平，只有D組與C組和S組相比有顯著性下降（P＜0.05），R組雖也降低但無(wú)顯著性差異（P＞0.05，表5）。

表5 TGFβ/BMP信號(hào)通路mRNA表達(dá)的比較Table 5 Comparison of the Expression of mRNAin TGFβ/BMP Signaling Pathway

2.4.2 不同方式運(yùn)動(dòng)后TGFβ/BMP信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

本研究發(fā)現(xiàn)，BMP2蛋白的表達(dá)水平與C組相比，S組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），R組和D組都非常顯著性增加（P＜0.01）；Smad1蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組C組相比，S組的無(wú)顯著性差異（P＞0.05），R組和D組顯著性增加（P＜0.05），與S組相比，R組和D組非常顯著性增加（P＜0.01）；TGFβ1蛋白的表達(dá)水平與C組相比，S組的無(wú)顯著性差異（P＞0.05），R組和D組的非常顯著性降低（P＜0.01），與S組相比，R組的顯著性降低（P＜0.05），D組的非常顯著性降低（P＜0.01，圖4，表6）。

圖4 不同方式運(yùn)動(dòng)后大鼠TGFβ/BMP相關(guān)蛋白表達(dá)比較Figure 4. Comparison of Expression of TGFβ/BMPProtein after Different Ways of Exercise

表6 TGFβ/BMP蛋白表達(dá)比較Table 6 Comparison of Expression of TGFβ/BMPProtein

3 分析與討論

3.1 不同方式的運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠后肢骨長(zhǎng)度的影響

運(yùn)動(dòng)作為一種非常有效的刺激方式，來(lái)調(diào)節(jié)或促進(jìn)身高的增加，這一點(diǎn)已在運(yùn)動(dòng)科學(xué)領(lǐng)域被證實(shí)。運(yùn)動(dòng)對(duì)身高確實(shí)是有非常重要的作用，但運(yùn)動(dòng)方式非常重要，并不是所有運(yùn)動(dòng)都會(huì)對(duì)四肢的增加有顯著性的作用。羅冬梅（2002）的研究中發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)能改善生長(zhǎng)期SD大鼠脛骨的長(zhǎng)度和PTHrP mRNA的表達(dá)，負(fù)重和懸吊不利于大鼠骨長(zhǎng)度的增加，但對(duì)此沒(méi)有進(jìn)一步的機(jī)制研究。而房冬梅（2007）的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)跑臺(tái)、持續(xù)游泳和間歇性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)都有利于骨的礦化，但游泳對(duì)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)的作用小于持續(xù)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，此結(jié)論和本實(shí)驗(yàn)一致。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，跑臺(tái)和下跳方式的運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠后肢脛骨和股骨長(zhǎng)度產(chǎn)生了非常顯著性的影響。羅冬梅采用的是負(fù)重運(yùn)動(dòng)模型，而本實(shí)驗(yàn)室采用的是游泳、跑步和下跳模型，這3種運(yùn)動(dòng)主要是后肢用力，所以實(shí)驗(yàn)也是以后肢作為主要研究部位。測(cè)試之后發(fā)現(xiàn)，R組和D組的后肢脛骨和股骨長(zhǎng)度相比C組和S組都有非常顯著性增加；而R組和D組之間，C組和S組之間無(wú)顯著性差異，這就說(shuō)明，游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠后肢長(zhǎng)長(zhǎng)作用不大，而跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和跳躍運(yùn)動(dòng)對(duì)生長(zhǎng)期大鼠后肢的增長(zhǎng)是非常有利的。

3.2 不同方式運(yùn)動(dòng)對(duì)生長(zhǎng)期大鼠生長(zhǎng)板寬度的影響

兒童青少年時(shí)期是人體軟骨內(nèi)成骨實(shí)現(xiàn)骨生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期，生長(zhǎng)板是兒童青少年時(shí)期特有的組織結(jié)構(gòu)，在這一時(shí)期骨生長(zhǎng)中，是通過(guò)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的不斷增殖、肥大和礦化來(lái)保證骨骼的縱向生長(zhǎng)有條不紊地進(jìn)行。生長(zhǎng)板是人體四肢縱向生長(zhǎng)的主要結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)和功能的變化，最終反映到身高上面。很多學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了研究，但大多都在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在運(yùn)動(dòng)科學(xué)領(lǐng)域很少，而且鮮見(jiàn)對(duì)生長(zhǎng)板的不同層的寬度百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本實(shí)驗(yàn)對(duì)生長(zhǎng)板的不同層寬度進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析，而且在細(xì)胞層面進(jìn)行了更為深入的探討，從影響其差異變化可能的各層百分比進(jìn)行了研究。

生長(zhǎng)板作為一種特殊的組織結(jié)構(gòu)，可以借助HE染色在生長(zhǎng)板細(xì)胞組織學(xué)中清晰觀察，反映生長(zhǎng)板組織學(xué)形態(tài)特征。生長(zhǎng)板包括靜息層軟骨細(xì)胞、增殖層軟骨細(xì)胞和肥大層軟骨細(xì)胞三層，各層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為：靜息層軟骨細(xì)胞體積小，呈圓點(diǎn)狀，細(xì)胞數(shù)量少；增殖層軟骨細(xì)胞呈扁平鐵餅狀，細(xì)胞數(shù)量多；肥大層軟骨細(xì)胞體積最大，顏色發(fā)亮，與增殖層軟骨細(xì)胞明顯不同。

不同方式運(yùn)動(dòng)的力學(xué)刺激會(huì)通過(guò)生長(zhǎng)板促進(jìn)或抑制生長(zhǎng)，因此，不同方式運(yùn)動(dòng)的力學(xué)刺激促進(jìn)或抑制生長(zhǎng)板生長(zhǎng)的關(guān)系值得重視。研究發(fā)現(xiàn)，力學(xué)刺激能夠影響生長(zhǎng)期骨的縱向生長(zhǎng)（Gkiatas et al.，2015；O’Conor et al.，2013；Rolfe et al.，2013）。但是這種力學(xué)刺激有個(gè)“閾值”，Ehrlich等（1972）研究發(fā)現(xiàn)，力學(xué)刺激強(qiáng)度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)板過(guò)快的老化或生長(zhǎng)停止，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)追趕生長(zhǎng)導(dǎo)致生長(zhǎng)板狹窄。Troib等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，跑臺(tái)訓(xùn)練結(jié)合生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH），能促進(jìn)CKD大鼠脛骨線狀生長(zhǎng)，而且對(duì)小梁骨形成顯示出有益的效果，優(yōu)于GH單獨(dú)治療，說(shuō)明合理的負(fù)荷有利于骨骼的縱向生長(zhǎng)，過(guò)低或者過(guò)高的負(fù)荷反而對(duì)骨骼的縱向生長(zhǎng)不利。Huang等（2002）的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練后，生長(zhǎng)板各層軟骨細(xì)胞數(shù)量、生長(zhǎng)板總寬度與未運(yùn)動(dòng)組不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Niehoff等（2004）、喬盼迪等（2016）研究也發(fā)現(xiàn)，無(wú)論高強(qiáng)度還是低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，生長(zhǎng)板中增殖層寬度與不運(yùn)動(dòng)組相比均顯著性降低。這個(gè)可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物年齡和運(yùn)動(dòng)方式有關(guān)，選擇的大鼠年齡大，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后已經(jīng)超過(guò)成年的18周，隨著年齡的增加、衰老導(dǎo)致肥大層寬度和生長(zhǎng)板總寬度降低，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度過(guò)大也會(huì)加速生長(zhǎng)板的衰老和退化，導(dǎo)致肥大層寬度和生長(zhǎng)板總寬度降低。

本實(shí)驗(yàn)采用不同方式的運(yùn)動(dòng)，通過(guò)生長(zhǎng)板組織染色，對(duì)生長(zhǎng)板的靜息層、增殖層、肥大層及生長(zhǎng)板各層相加計(jì)算出生長(zhǎng)板總的寬度，以及各層在總寬度所占百分比的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，來(lái)探討運(yùn)動(dòng)對(duì)于生長(zhǎng)板軟骨內(nèi)成骨的影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同方式運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組相比生長(zhǎng)板靜息層沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，增殖層也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但肥大層S組和R組與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但D組與C組和S組相比非常顯著性增加，與R組沒(méi)有顯著性差異，生長(zhǎng)板總寬度也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；緊接著對(duì)各層占總寬度百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，靜息層所占百分比出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，R組、D組和C組、S組比較都顯著性降低，但增殖層所占百分比沒(méi)有出現(xiàn)差異，肥大層所占百分比R組、D組也顯著性增加。簡(jiǎn)單地說(shuō)就是跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和下跳運(yùn)動(dòng)后生長(zhǎng)板靜息層寬度變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但所占生長(zhǎng)板總長(zhǎng)度百分比出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和下跳運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致靜息層的下降，但增殖層都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而肥大層出現(xiàn)顯著上升。不同方式的運(yùn)動(dòng)的力學(xué)刺激不同，導(dǎo)致生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞各層產(chǎn)生了不同的變化，出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能有以下幾方面：1）靜息層骨細(xì)胞數(shù)量減少，可能由于跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和下跳運(yùn)動(dòng)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增值率增加導(dǎo)致；2）既然增值率增加，增殖層寬度理論上應(yīng)該增加，但是沒(méi)有發(fā)生變化，可能是由于肥大速率加快導(dǎo)致增殖速率被抵消；3）跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和下跳運(yùn)動(dòng)可能確實(shí)能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的肥大成熟，使得生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞肥大速率增加。

3.3 不同方式運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠生長(zhǎng)板肥大軟骨細(xì)胞數(shù)量的影響

生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞肥大化的程度，在很大程度上決定了長(zhǎng)骨的增長(zhǎng)速率。在同齡大鼠中，生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞肥大個(gè)數(shù)越多，說(shuō)明細(xì)胞成熟的越多，生長(zhǎng)板在長(zhǎng)骨縱向生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮的作用、貢獻(xiàn)也就越高。本研究發(fā)現(xiàn)，R組和D組生長(zhǎng)板肥大軟骨細(xì)胞的數(shù)量都出現(xiàn)明顯增多，肥大細(xì)胞數(shù)量的增多也就意味著肥大軟骨細(xì)胞層面積的增加，這與前面統(tǒng)計(jì)得出的R組和D組后肢股骨生長(zhǎng)板肥大層寬度和肥大層百分比顯著性增加是一致的，說(shuō)明跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和下跳運(yùn)動(dòng)能促進(jìn)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的肥大，有利于軟骨內(nèi)成骨，促進(jìn)骨的縱向生長(zhǎng)。

3.4 不同方式運(yùn)動(dòng)對(duì)生長(zhǎng)期大鼠生長(zhǎng)板TGFβ/BMP信號(hào)通路的影響

BMP在調(diào)控軟骨細(xì)胞分化成熟中作用不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)，BMP2有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、肥大的作用，在軟骨修復(fù)和骨折恢復(fù)治療領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛，由于BMP2在骨修復(fù)過(guò)程中既有促進(jìn)合成代謝，又有促進(jìn)分解代謝的作用，所以已被允許用于脊椎融合及長(zhǎng)骨腔骨的急性開放性治療。尤其在修復(fù)治療長(zhǎng)骨缺損中，BMP2能促進(jìn)骨吸收，加速骨的重建（Tannoury et al.，2014）。在軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中也同樣具有促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨的作用。但BMP4作用正好與其相反，在體內(nèi)、外的研究發(fā)現(xiàn)，BMP4可促進(jìn)MSC分泌Col2及蛋白聚糖，促進(jìn)MSC向軟骨細(xì)胞分化，同時(shí)又抑制軟骨細(xì)胞肥大（Pregizer et al.，2015）。目前，比較不同運(yùn)動(dòng)方式通過(guò)調(diào)節(jié)BMP來(lái)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的分化和軟骨內(nèi)成骨的研究還較少。

體內(nèi)和體外的研究發(fā)現(xiàn)，BMP能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的增殖，增加骨的元素，如果缺失BMP信號(hào)通路或者過(guò)表達(dá)BMP的拮抗劑，或者顯性抑制BMP受體的形成，都會(huì)降低骨骼的縱向生長(zhǎng)。已經(jīng)證明，BMP信號(hào)通路和Ihh信號(hào)通路有幾個(gè)階段是相互影響并調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)育的，同時(shí)平行調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖。BMP又誘導(dǎo)細(xì)胞釋放Ihh，直接調(diào)控軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大。此外，軟骨細(xì)胞的肥大過(guò)程獨(dú)立于Ihh/PTHrP信號(hào)通路，受BMP信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖（Minina et al.，2002），并通過(guò)負(fù)反饋循環(huán)與Ihh/PTHrP一起調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖成熟（Salazar et al.，2016）。

BMPI型受體有兩種，包括：BMPRA1和BMPRB1，可以激活磷酸化同樣的下游信號(hào)通路Smad1、5、8（Presley et al.，2017；Wan et al.，2005），即使 PTHrP存在時(shí)，BMP也能導(dǎo)致Ihh的高表達(dá)，Ihh信號(hào)通路在生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞成熟階段不依賴于BMP的調(diào)節(jié)，Ihh的表達(dá)貫穿于生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞成熟的始終，BMP在Ihh的表達(dá)上起著重要的調(diào)節(jié)作用，高水平的BMP必然在下游信號(hào)通路Smad1、5、8調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞成熟方面引起Ihh的升高（Ma et al.，2013），PTHrP通過(guò)調(diào)控BMP信號(hào)通路調(diào)控Ihh的表達(dá)，PTHrP負(fù)調(diào)控Ihh不一定是直接的，可能通過(guò)BMP信號(hào)通路（Grimsrud et al.，2010）。還有其他一些機(jī)制如胞外的粘合蛋白會(huì)抑制胞內(nèi)信號(hào)通路如BMP，這些信號(hào)通路間的復(fù)雜平衡一起調(diào)節(jié)骨的形成和骨的縱向生長(zhǎng)（Estrada et al.，2013；Luo，2016；Zhang et al.，2017）。

生長(zhǎng)板軟骨通過(guò)一個(gè)程序性的細(xì)胞增殖、肥大、分化、鈣化、凋亡，最終被骨取代。TGFβ信號(hào)被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)Smads信號(hào)。Smad1、5、8對(duì)BMP信號(hào)通路起作用，Smad2、3對(duì)TGFβ信號(hào)通路起作用。Smad3功能的缺失會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞對(duì)TGFβ響應(yīng)降低。Smad3在發(fā)育階段不會(huì)影響軟骨的形成，但在3～4周的Smad3-/-小鼠發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)板肥大帶逐漸增加，這個(gè)表型在5～6周的成熟小鼠變得更加明顯，這說(shuō)明Smad3的缺失導(dǎo)致生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的肥大分化。研究還發(fā)現(xiàn)，在Smad3-/-小鼠生長(zhǎng)板Col10表達(dá)增加，蛋白多糖含量下降，而且TGFβ1處理的小鼠抑制軟骨細(xì)胞的肥大而不是Smad3-/-，說(shuō)明TGFβ1在抑制軟骨細(xì)胞的肥大分化方面作用是大于Smad3的。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和C組比較，S組BMP/Smad1、5、8信號(hào)通路未發(fā)生顯著性變化，而R組和D組發(fā)生顯著性變化，而且在mRNA水平D組BMP2較R組也有顯著性差異，這兩種方式的運(yùn)動(dòng)通過(guò)BMP信號(hào)通路作用于下游Smad1、5、8，促進(jìn)了軟骨細(xì)胞肥大和礦化階段Col10和MMP13的表達(dá)，進(jìn)而反映這兩種方式促進(jìn)了生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的增殖和肥大，但由于僅在Smad8蛋白上D組較R組出現(xiàn)顯著性差異，還不能說(shuō)明D組較R組的運(yùn)動(dòng)方式更有利于軟骨內(nèi)成骨。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，BMP的上升有利于骨量的增加，但在本研究可能是多條信號(hào)通路共同作用的結(jié)果。而且TGFβ1在mRNA水平和蛋白水平都在R組和D組較C組和S組出現(xiàn)了顯著性差異，而S組和C組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)軟骨細(xì)胞的肥大作用不是很有效，和生長(zhǎng)板數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致。R組和D組的顯著性下降可能與生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的肥大和肥大層寬度增加有關(guān)，且蛋白表達(dá)上D組較R組出現(xiàn)的下降更為顯著，這些效果的累加，也是可能導(dǎo)致Runx2顯著升高的原因，最終導(dǎo)致軟骨內(nèi)成骨加強(qiáng)，骨的縱向生長(zhǎng)明顯。

4 結(jié)論

跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和下跳運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)激活生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞BMP信號(hào)通路，抑制TGFβ1信號(hào)通路，增加生長(zhǎng)期大鼠生長(zhǎng)板肥大層的寬度百分比和肥大軟骨細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)生長(zhǎng)期大鼠后肢骨脛骨和股骨長(zhǎng)度，且效果優(yōu)于游泳運(yùn)動(dòng)。