劉春苗，孫東蘭，于 湄，張 靜，楊玉秀，孟雁欣*

(1.河北省石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)一科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，河北 石家莊 050011)

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)是一組脊髓前角及腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性、丟失，導(dǎo)致的以緩慢進(jìn)行性加重、肢體近端對(duì)稱性肌無(wú)力、肌萎縮為主要臨床表現(xiàn)的遺傳性骨骼肌疾病，呈常染色體隱性遺傳[1]。95%的SMA由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因(survival motor neuron,SMN)拷貝缺失致病，5%SMN點(diǎn)突變致病。嬰幼兒、青少年為主要發(fā)病人群。群體發(fā)病率1/6 000～1/10 000，攜帶頻率1/35～1/42，無(wú)明顯地域及人口種族差異性[2-3]。SMA存在診斷分型難，兒童發(fā)病、致死率高、藥物治療費(fèi)用極高且治療手段有限等科學(xué)問(wèn)題。全美醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)推薦將SMA攜帶者產(chǎn)前篩查納入常規(guī)孕前檢查項(xiàng)目[4]。本研究以分子生物學(xué)方法對(duì)4 568例樣本進(jìn)行SMA攜帶者篩查，并建立SMA分子生物學(xué)診斷、鑒別診斷平臺(tái)同時(shí)完善該病產(chǎn)前策略，報(bào)告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2017年1月—2018年12月因孕前檢查于石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診的患者4 568例，女性2 480例，男性2 088例，對(duì)檢出的攜帶者配偶126例及夫婦雙方均為攜帶者25對(duì)孕期胎兒行針對(duì)性檢測(cè)。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者均知情同意且簽署知情同意書(shū)。

1.2介入性產(chǎn)前診斷 孕婦取仰臥位，常規(guī)消毒鋪巾，超聲定位穿刺部位。孕12周孕婦13例行絨毛穿刺術(shù)，由專人超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹部或經(jīng)陰道抽取妊娠絨毛組織25 mg；余孕18周后行羊水穿刺術(shù)，由專人經(jīng)腹部抽取羊水30 mL。

1.3分子生物學(xué)方法

1.3.1DNA提取、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增 抽取3 mL外周血，天根DNA提取試劑盒獲得基因組DNA。

羊水細(xì)胞培養(yǎng)，7 d后以生理鹽水反復(fù)沖洗5～6次貼壁羊水細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞收集，應(yīng)用天根DNA細(xì)胞基因組試劑盒提取胎兒羊水細(xì)胞基因組DNA。NanoDrop1000微量核苷酸蛋白多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Gene公司)定量分析(OD260/OD280比值1.8～2.0)，-80 ℃保存余DNA樣本。Prime 6軟件設(shè)計(jì)引物，覆蓋SMN1/KRIT1/CYBB全長(zhǎng)，包括目的基因片段各個(gè)外顯子及與內(nèi)含子交界區(qū)，Pubmed blast比對(duì)引物(表1)。KRIT1/CYBB為內(nèi)參基因。PCR擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃ 10 min熱啟動(dòng)預(yù)變性，95 ℃ 30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 60 s，共25個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min。

1.3.2Denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC)分析 樣本完成PCR擴(kuò)增進(jìn)行DHPLC檢測(cè)。5 μL PCR反應(yīng)樣本上機(jī)(美國(guó)環(huán)球基因公司)，選擇類型DS Multiple Fragment，溫度50 ℃，上樣、洗脫。應(yīng)用儀器自帶軟件計(jì)算SMN1/KRIT1比值，SMN1/KRIT1等于0純合缺失，雜合缺失或攜帶為0.5，正常人為1。以SMN1/KRIT1比值作為校正系數(shù)，所有比值按照校正系數(shù)進(jìn)行比對(duì)后得出數(shù)據(jù)。

1.3.3Sanger法測(cè)序 美國(guó)ABI 3730XL(Applied Biosystems,Foster City,CA)自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。Sequencher v4.1(Gene Codes,Ann Arbor,MI,USA)比對(duì)分析，致病變異位點(diǎn)進(jìn)行家系成員靶向檢測(cè)分析。分析變異序列與疾病表型有無(wú)共分離現(xiàn)象，進(jìn)行基因變異位點(diǎn)定位、明確氨基酸變化及功能改變。

2 結(jié) 果

2.1DHPLC檢測(cè)結(jié)果 研究以DHPLC方法對(duì)入選4 568例樣本進(jìn)行SMN 1外顯子進(jìn)行拷貝缺失檢測(cè)，2例SMN1外顯子7/8純合缺失(SMA患者)，父母雙方驗(yàn)證SMN1外顯子7/8雜合缺失，拷貝數(shù)“1”(典型SMA攜帶者)，余樣本中未見(jiàn)SMN1外顯子7及外顯子8純合缺失；共計(jì)檢測(cè)到攜帶者126例，攜帶頻率1/36，其中SMN1外顯子7/8雜合缺失84例，拷貝數(shù)均為“1”，僅SMN1外顯子7拷貝數(shù)“1”31例，單獨(dú)SMN1外顯子8拷貝數(shù)“1”11例，致病基因攜帶頻率1/40。聯(lián)系并告知上述攜帶者配偶并在其知情同意基礎(chǔ)上對(duì)其抽取外周血進(jìn)行SMN 1外顯子拷貝變異檢測(cè)，25例配偶樣本證實(shí)為SMN1外顯子7/8雜合缺失，即拷貝數(shù)均為“1”，致病攜帶率1/50(圖1)。

圖1 DHPLC檢測(cè)SMN1缺失檢測(cè)

2.2Sanger測(cè)序檢測(cè)結(jié)果 研究對(duì)4 568例樣本進(jìn)行SMN1點(diǎn)突變變異檢測(cè)，明確1例SMN1外顯子7/8雜合缺失攜帶者拷貝數(shù)為“1”樣本同時(shí)攜帶p.Q164X點(diǎn)突變變異位點(diǎn)，臨床診斷為“1+1型”SMA患者，告知該樣本父母檢測(cè)結(jié)果并知情同意前提下對(duì)父母行SMN1缺失及點(diǎn)突變檢測(cè)，證實(shí)其母為SMN1外顯子7及外顯子8雜合缺失攜帶者，其父親為p.Q164X點(diǎn)突變攜帶者(圖2)。余樣本(含拷貝缺失攜帶者配偶)未檢測(cè)出致病意義明確變異位點(diǎn)。

圖2 SMN1 Sanger測(cè)序分析結(jié)果

2.3SMA攜帶者高危胎兒產(chǎn)前診斷 研究對(duì)上述SMA攜帶者中25對(duì)夫婦(含點(diǎn)突變夫婦)胎兒于孕18周行羊水穿刺，并應(yīng)用DHPLC及Sanger測(cè)序技術(shù)進(jìn)行SMN1拷貝數(shù)及點(diǎn)突變變異檢測(cè)。結(jié)果顯示SMN1外顯子7/8純合缺失(SMA患者)胎兒3例；SMN1外顯子7/8雜合缺失(SMA攜帶者)胎兒1例。余胎兒檢測(cè)未見(jiàn)SMN1拷貝數(shù)異常(圖3)。Sanger測(cè)序1例胎兒攜帶p.Q164X點(diǎn)突變變異位點(diǎn)，余樣本未見(jiàn)SMN異常。

圖3 DHPLC對(duì)SMA攜帶者高危胎兒SMN1檢測(cè)分析

3 討 論

SMA是僅次于杜興型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)常見(jiàn)的神經(jīng)骨骼肌疾病，也是目前已知除囊性纖維變外最常見(jiàn)致死性極高的常染色體隱性遺傳病。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局于2019年批準(zhǔn)首個(gè)治療SMA基因治療藥物Zolgensma(onasemnogene abeparvovec-xioi)上市并應(yīng)用于臨床，但1劑用藥212萬(wàn)美元的高昂費(fèi)用且僅針對(duì)2歲以下兒童用藥范圍限制了其短期內(nèi)臨床普及進(jìn)度[5-6]。因此，臨床對(duì)先證者早期診斷及攜帶者早期篩查有重要意義。既往研究證實(shí)[7-8]：①染色體5q11.2-q13.3區(qū)域SMN變異導(dǎo)致脊髓前角細(xì)胞與腦干內(nèi)運(yùn)動(dòng)核進(jìn)行性變性為其發(fā)病機(jī)制；②SMA是嬰兒期最常見(jiàn)致死性遺傳?。虎奂‰妶D、肌酶和肌肉活檢診斷特異度不高，分子生物學(xué)診斷檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”；④“SMA 0型”被報(bào)道，遺傳學(xué)超聲可見(jiàn)宮內(nèi)胎動(dòng)明顯減少，如不及時(shí)采取措施，1歲內(nèi)即死亡。上述特征為SMA臨床診斷、分型、治療、預(yù)防提出了難題。分子生物學(xué)技術(shù)逐漸成為不可取代的診斷、分型SMA“金標(biāo)準(zhǔn)”。悉數(shù)SMA分子檢測(cè)手段，由最初的聚合酶鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、DHPLC、PCR技術(shù)、到多重連接依賴式探針擴(kuò)增(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)[9]，技術(shù)手段各有優(yōu)劣，尋找精準(zhǔn)、有效、經(jīng)濟(jì)的分子檢測(cè)手段成為臨床醫(yī)生關(guān)注的焦點(diǎn)。

我國(guó)學(xué)者對(duì)338例SMA疑似患兒行PCR-RFLP分析中發(fā)現(xiàn)267例為純合缺失，另外88例中17例符合SMA國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過(guò)DHPLC驗(yàn)證為雜合缺失；同時(shí)有研究證實(shí)在對(duì)85例臨床疑似SMA患兒進(jìn)行PCR-RFLP分析57例考慮純合缺失，另外19例陰性患兒后期隨訪過(guò)程中發(fā)現(xiàn)并不符合SMA診斷。由此我們不難發(fā)現(xiàn)單獨(dú)依靠PCR-RFLP容易造成SMA誤診、漏診，同時(shí)單將限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析用于產(chǎn)前診斷無(wú)法準(zhǔn)確判斷母源污染而存在假陰性率。與PCR-RFLP技術(shù)相比，DHPLC是一類單核苷酸多態(tài)性研究中常見(jiàn)技術(shù)，能明確患兒及其親屬SMN缺失、雜合缺失情況并解決酶切不完全、限制酶失效等問(wèn)題，此外還具備成本低、檢測(cè)快速、通量高等優(yōu)勢(shì)[10]。本研究基于SMA流行病學(xué)報(bào)道及發(fā)病特征，選擇DHPLC進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合單基因靶向測(cè)序技術(shù)進(jìn)行“點(diǎn)突變”致病位點(diǎn)檢測(cè)篩查，二者有效結(jié)合，防“漏篩”同時(shí)有效降低消耗成本。

研究結(jié)果中128例SMN 1拷貝異常樣本中2例明確SMA，余126例攜帶者，攜帶頻率1/36，與1/35～1/168不同人群攜帶波動(dòng)頻率比較[11]，我省地區(qū)攜帶頻率與歐美國(guó)家及我國(guó)南方人群(含臺(tái)灣地區(qū))遺傳流行病學(xué)研究報(bào)告攜帶頻率1/25～1/50較為一致。眾所周知，SMN1中外顯子7決定SMA臨床表型及致病意義，SMA患者SMN1一般表現(xiàn)為外顯子7、8同時(shí)缺失或僅外顯子7純合缺失。SMN1中外顯子8缺失與否并不能導(dǎo)致SMN1編碼蛋白結(jié)構(gòu)及功能的改變，而且鮮有SMN1外顯子8缺失致病報(bào)道[12]，因此SMN1外顯子7缺失被公認(rèn)為SMA致病原因。但SMA患者SMN1與SMN2轉(zhuǎn)化過(guò)程中會(huì)引起外顯子8的多態(tài)性改變，因此8號(hào)外顯子缺失通常作為后期隨訪及觀察組，也是SMN1基因缺失中不可缺少的分析位點(diǎn)[13]。

測(cè)序技術(shù)是SMN1缺失檢測(cè)有效補(bǔ)充，既可以對(duì)患者進(jìn)行疾病熱點(diǎn)突變位點(diǎn)-臨床表型分析也可以靶向判斷堿基改變，對(duì)新發(fā)變異突變位點(diǎn)與遺傳病間關(guān)系研究起著不可替代的作用。本研究1例“1+1”型SMA樣本Sanger測(cè)序結(jié)果顯示位于6號(hào)外顯子無(wú)義突變位點(diǎn)p.Q164X為亞洲人群首報(bào)且經(jīng)蛋白水平檢測(cè)致病意義明確。迄今，已發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變致病位點(diǎn)約30余個(gè)且多分布于3號(hào)/6號(hào)外顯子[13]，本研究證實(shí)6號(hào)外顯子為“熱點(diǎn)突變”占據(jù)地。這一檢測(cè)結(jié)果填補(bǔ)了中國(guó)SMA點(diǎn)突變基因數(shù)據(jù)庫(kù)。該SMA患兒臨床發(fā)病晚、癥狀輕，僅表現(xiàn)雙下肢肌力減退及遠(yuǎn)端肌輕度萎縮。Wu等[14]指出SMA患者臨床表型嚴(yán)重程度除與SMN1與SMN2“劑量補(bǔ)償”有關(guān)，“1+1型”患者臨床表型與“點(diǎn)突變”類型密切相關(guān)，如無(wú)義突變致病較輕微，而嚴(yán)重的1型患者多與移碼突變相關(guān)。我們對(duì)樣本親緣驗(yàn)證示SMN1缺失變異源自其母，p.Q164X源自其父。該驗(yàn)證結(jié)果與約2%新發(fā)點(diǎn)突變變異位點(diǎn)中大部分源于父系報(bào)道一致[15]。因此，點(diǎn)突變測(cè)序技術(shù)是SMA分型診斷必不可少的檢測(cè)途徑。

基因篩查與基因診斷最大的區(qū)別就是應(yīng)用人群及檢測(cè)目標(biāo)的差異，但卻有著相同的遺傳學(xué)基礎(chǔ)及極為相似的檢測(cè)手段，因此人群攜帶者篩查最終落實(shí)的實(shí)際意義在于指導(dǎo)高危家庭的遺傳咨詢、妊娠及如何規(guī)避缺陷患兒出生。SMA作為AR遺傳病符合孟德?tīng)栠z傳定律，即如夫婦雙方均為攜帶者，子代表現(xiàn)為25%發(fā)病，50%攜帶，25%正常[16]。本研究對(duì)前期明確25對(duì)SMA攜帶者夫婦胎兒行介入性產(chǎn)前診斷SMA占12%，攜帶率達(dá)8%。該數(shù)據(jù)證實(shí)SMA產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷極為重要，實(shí)際臨床工作中醫(yī)療環(huán)境及醫(yī)生認(rèn)識(shí)問(wèn)題使部分醫(yī)生忽略SMA攜帶者篩查指導(dǎo)及產(chǎn)前策略分析。

目前已知SMA患兒防治技術(shù)主要有：①SMA無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷，通過(guò)檢測(cè)孕婦外周血中胎兒游離DNA及對(duì)孕婦中胎兒有核細(xì)胞進(jìn)行富集后而進(jìn)行的胎兒遺傳學(xué)診斷；②通過(guò)胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)對(duì)胚胎基因組變異進(jìn)行明確診斷并剔除不良胚胎；③基于攜帶者篩查基礎(chǔ)上于孕中期行胎兒產(chǎn)前診斷[17-19]。顯然，產(chǎn)前診斷是最精準(zhǔn)、經(jīng)濟(jì)、有效的手段。那么在我國(guó)什么樣的人群適合SMA攜帶者篩查呢，當(dāng)然，對(duì)于各項(xiàng)醫(yī)療保障制度完善的地區(qū)我們提倡“譜篩”，指導(dǎo)攜帶者夫婦遺傳咨詢及生育并選擇產(chǎn)前診斷最佳時(shí)機(jī)；對(duì)于無(wú)條件執(zhí)行譜篩的醫(yī)療條件下我們建議對(duì)下列人群靶向進(jìn)行SMA攜帶者篩查：①既往生育過(guò)SMA患兒的夫婦；②遺傳學(xué)超聲提示胎兒胎動(dòng)少，伴有室間隔缺損及四肢姿勢(shì)固定、關(guān)節(jié)攣縮的影像學(xué)表現(xiàn)；③夫婦雙方家系中均有SMA發(fā)病病史的；④夫婦雙方一方攜帶者或患者欲生育的；⑤先證者經(jīng)基因診斷明確的高危產(chǎn)婦的。Chen等[20]對(duì)SMA篩查評(píng)估證實(shí)SMA患兒從2003年90.62%逐漸下降到2014年的20.83%，且檢測(cè)結(jié)果益處大于弊處。由此可見(jiàn)，精準(zhǔn)篩查、嚴(yán)格把控篩查指征及科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)遺傳指導(dǎo)可有效降低SMA缺陷患兒的出生，造福人類。

綜上所述，SMA攜帶者篩查可謂是預(yù)防措施的“雙刃劍”。SMA精準(zhǔn)的篩查可以降低SMA患兒的出生，提供有效的遺傳咨詢信息，如預(yù)測(cè)不同人群地區(qū)種族的攜帶及發(fā)病頻率，更可作為遺傳評(píng)估手段用于輔助生殖，使家庭再次生育健康孩子的愿望得以實(shí)現(xiàn)。我國(guó)學(xué)者Tisdale等[17]早期曾建立了對(duì)先證者進(jìn)行拷貝及點(diǎn)突變檢一套完整檢測(cè)系統(tǒng)，指出建立完整的SMA攜帶者篩查流程在該病預(yù)防及遺傳咨詢中有重要作用，因此我們認(rèn)為完善的攜帶者篩查分析進(jìn)行拷貝缺失、點(diǎn)突變檢測(cè)分析固然重要，但對(duì)于種族及地區(qū)間的差異分析也是評(píng)估攜帶者篩查的重要因素。本研究通過(guò)上述人群研究總結(jié)出河北地區(qū)人口SMA人群攜帶頻率及發(fā)病頻率。明確攜帶者基礎(chǔ)上，進(jìn)行規(guī)范遺傳咨詢及生育指導(dǎo)。