李新玲，吳振國，張立海，朱頎峰

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的85%［1］。目前，NSCLC的治療以外科手術(shù)結(jié)合放化療、分子靶向治療為主；盡管這些治療方法對患者預(yù)后有所改善，但由于該病復(fù)發(fā)率高，5年生存率依然沒有較大提高。侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤重要的生物學(xué)特征，也是造成腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，深入研究NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移的機制是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。研究表明，miR?208a在腫瘤中的異常表達，參與影響乳腺癌［2?3］、結(jié)腸癌［4］、胃癌［5?6］等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但在NSCLC中的報道少見。蛋白酪氨酸磷酸酶受體G（PTPRG）是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一員，主要參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、周期以及腫瘤轉(zhuǎn)化等生物過程。研究發(fā)現(xiàn)PTPRG過表達可抑制鼻咽癌細胞的生長和侵襲［7］，以及乳腺癌的進展［8］。本研究通過過表達和干擾NSCLC細胞miR?208a表達，探討miR?208a對NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移的影響，并驗證miR?208a與PTPRG的靶向關(guān)系，為NSCLC的臨床治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人NSCLC細胞A549購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；人腎胚細胞HEK?293T購自武漢普諾賽生命科技有限公司；RPMI 1640、胎牛血清、青/鏈霉素雙抗、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；CCK?8試劑盒、結(jié)晶紫染色液、細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；鼠源GAPDH一抗、兔源PTPRG一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、ECL化學(xué)發(fā)光底物、SDS?PAGE蛋白上樣緩沖液購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；蛋白Marker、RNA提取試劑盒購自美國賽默飛公司；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自日本Takara公司、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加尾法）購自上海冠泰生物科技有限公司；PVDF膜購自美國密理博公司；雙熒光素報告酶試劑盒購自美國Promega公司。多功能酶標儀（Thermo公司，美國），電泳儀（六一儀器廠，北京），CO2細胞培養(yǎng)箱（松下，日本），實時熒光定量PCR（qPCR）儀（ABI，美國），倒置顯微鏡（Olympus，日本），超凈工作臺（蘇潔醫(yī)療器械有限公司，蘇州），高速冷凍離心機（貝克曼，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)A549細胞采用含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，細胞置于培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。每隔1～2 d進行換液，待細胞融合度達到80%～90%時，用胰蛋白酶消化，進行1∶3傳代。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組取處于指數(shù)生長期的A549細胞，接種于細胞培養(yǎng)板中。將細胞預(yù)培養(yǎng)12 h，待細胞融合度達到60%～80%時將培養(yǎng)基更換成無血清無雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法參照lipofectamine 2000試劑盒說明書進行操作。轉(zhuǎn)染組包含4組：miR?208a mimic組、NC mimic組、miR?208a inhibitor組和NC inhibitor組。NC mimic，miR?208a mimic，NC inhibitor和miR?208a inhibitor均由廣州銳博生物科技 有 限 公 司 合 成。序 列miR?208a mimic：5'?AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU?3'；miR?208a inhibitor：5'?UAUUCUGCUCGUUUUUCGAACA?3'；NC mimic：5'?UUCUC CGAACGUGUCACGUTT?3'；NC inhibitor：5'?CAGUACUU UUGUGUAGUACAA?3'。

1.2.3 CCK?8實驗取處于指數(shù)生長期的A549細胞，以5×103個/孔接種于96孔板中。細胞預(yù)培養(yǎng)12 h后進行細胞轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染完成后，分別于0、24、48和72 h檢測增殖情況。將10μL CCK?8溶液加入到96孔板中，在37℃下孵育1～4 h，用多功能酶標儀檢測450 nm波長處光密度（OD）值，每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.4 劃痕實驗在6孔板背面用記號筆平行劃下3條標記線，用于劃痕實驗記錄位置。取轉(zhuǎn)染后的4組細胞，以1×106/孔接種于6孔板中。用10μL槍頭在細胞培養(yǎng)板中劃下3條垂直于標記線的劃痕。用PBS潤洗，洗掉漂浮的細胞。選取3個劃痕位置，分別于0 h和24 h進行拍照，記算細胞劃痕遷移率。遷移率=（0 h劃痕寬度?24 h的劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.5 Transwell實驗在Transwell板上室中提前加入Matrigel基質(zhì)膠，在細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h左右備用。4組細胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰蛋白酶消化，用400μL無血清細胞培養(yǎng)液重懸細胞。吸取100μL的細胞懸液，接種至Transwell上室，下室加入600μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。24 h后，吸取上室中的培養(yǎng)液，用脫脂棉花輕輕擦掉上室中未侵襲到底部的細胞。隨后將小室置于4%多聚甲醛溶液中，于4℃固定20 min，然后用0.1%結(jié)晶紫溶液室溫染色15 min。隨機讀取5個視野進行拍照，計算細胞侵襲數(shù)量。

1.2.6 生物信息學(xué)分析miR?208的靶基因應(yīng)用PicTar（https://pictar.mdc?berlin.de）、miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）、Targetscan（http://www.targetscan.org/mamm_31/）和miRDB（http://mirdb.org/）4個數(shù)據(jù)庫分析與miR?208a結(jié)合的下游靶基因，并通過維恩圖（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）求交集。隨后，通過GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer?pku.cn/）檢索PTPRG在肺腺癌（LUAD）和肺鱗癌（LUSC）中的表達量。

1.2.7 雙熒光素報告酶實驗通過PCR擴增PTPRG的3'UTR序列，克隆至pGL3質(zhì)粒構(gòu)建野生型質(zhì)粒。隨后用點突變試劑盒對miRNA與mRNA 3'UTR的結(jié)合位點的質(zhì)粒進行點突變，得到突變型質(zhì)粒。取指數(shù)生長期HEK?293T細胞，接種于24孔板中，細胞預(yù)培養(yǎng)12 h后進行細胞轉(zhuǎn)染。將miR?208a mimic/miR?208a inhibitor與包含PTPRG的3'UTR序列的野生型/突變型質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到HEK?293T細胞中，并用NC mimic和NC inhibitor作為對照。轉(zhuǎn)染48 h后，參照試劑盒說明書檢測各組細胞的熒光素酶活性，并用海腎熒光活性對實驗結(jié)果進行標準化。

1.2.8 qPCR取各組轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書進行操作，提取細胞總RNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于?20℃保存。隨后，利用qPCR檢測mRNA和miRNA的表達水平，GAPDH和U6分別作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為：SYBR premix 12.5μL，PCR上下游引物各0.5 μL，DNA模板2μL，dH2O 9.5μL，總體積25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性5 s，60℃反應(yīng)30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)完成后，采用2?ΔΔCt法計算mRNA和miRNA的相對表達量。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.9 Western blot各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，棄去細胞培養(yǎng)上清，用冰PBS潤洗細胞3次。加入細胞裂解液，冰上裂解30 min。隨后12 000×g離心15 min，吸取上清，得到細胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。定量后取30μg蛋白上樣，進行10%SDS?PAGE凝膠電泳，待蛋白Marker完全分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。隨后用5%脫脂奶粉封閉2 h，用含1%吐溫20的TBS洗膜，加入PTPRG一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜后二抗（1∶10 000），37℃孵育2 h。最后加入ECL化學(xué)發(fā)光液進行顯影，以GAPDH作為內(nèi)參，用Image J對蛋白條帶進行灰度分析。

1.2.10 PTPRG與miR?208a的靶向關(guān)系驗證取處于指數(shù)生長期的A549細胞，設(shè)陰性對照組（si?NC組）、PTPRG敲低組（si?PTPRG組）和PTPRG敲低組+miR?208a干擾組（si?PTPRG+miR?208a inhibitor組）。各組培養(yǎng)12 h后分別進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后采用CCK?8、Transwell實驗和劃痕實驗檢測PTPRG對A549增殖、侵襲和遷移的影響，qPCR和Western blot檢測3組細胞PTPRG的mRNA和蛋白表達變化。si?NC和si?PTPRG均由廣州銳博生物科技有限公司合成，si?PTPRG序列為5'?GTCCCTTTTGTCGCGGTAG?3'。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)應(yīng)用Graphpad 8.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（x±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey?t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?208a的轉(zhuǎn)染效率驗證轉(zhuǎn)染48 h后，miR?208a mimic組miR?208a表達水平較NC mimic組上調(diào)約10.28倍（t=16.950，P＜0.01），而miR?208a inhibitor組miR?208a表達較NC inhibitor組下調(diào)約74%（t=19.340，P＜0.01），見圖1。

Fig.1 The transfection efficiency of miR?208a in A549 cells detected by qPCR圖1 qPCR檢測miR?208a在A549細胞中的轉(zhuǎn)染效率

2.2 過表達和沉默miR?208a對A549細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響CCK?8結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR?208a mimic組在24、48、72 h細胞增殖能力明顯升高（P＜0.05）；而沉默miR?208a后，miR?208a inhibitor組在24、48、72 h細胞增殖能力較NC inhibitor組明顯下降，見表2。劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR?208a mimic組遷移率升高，細胞侵襲數(shù)增多（P＜0.01）；而沉默miR?208a后，miR?208a inhibitor組遷移率和細胞侵襲數(shù)較NC inhibitor組明顯下降，見圖2、3，表3。

Tab.2 Changes of the proliferation in A549 cells after overexpression and knockdown of miR-208a表2 過表達和敲低miR-208a后A549細胞增殖能力變化（n=3，OD450，x±s）

Tab.3 Changes of migration and invasion ability in A549 cells after overexpression and knockdown of miR-208a表3 過表達和敲低miR-208a后A549細胞遷移和侵襲能力變化 （n=3，x±s）

2.3 生物信息學(xué)分析尋找miR?208的靶基因通過PicTar、miRanda、Targetscan和miRDB共4個數(shù)據(jù)庫分別查詢miR?208a的靶基因，并通過維恩圖求交集，最終得到38個交集基因，其中包括PTPRG。隨后，通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)PTPRG在肺腺癌和肺鱗癌中的表達量均高于癌旁組織，見圖4。因此選擇PTPRG作為后續(xù)的研究對象。

2.4 雙熒光素報告酶實驗結(jié)果雙熒光素報告酶實驗結(jié)果顯示，miR?208a mimic/miR?208a inhibitor與PTPRG 3'UTR野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，細胞熒光素酶活性分別較各自對照質(zhì)粒下降或升高（P＜0.01）。而miR?208a mimic/miR?208a inhibitor與PTPRG 3'UTR突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK?293T細胞后，熒光素酶活性與各自對照質(zhì)粒組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5，表4。

Fig.4 Bioinformatics analysis of miR?208a target genes圖4 生物信息學(xué)分析miR?208a的靶基因

Fig.5 Double luciferase reporter assay verified the 3'UTR of miR?208a targeting PTPRG圖5 雙熒光素報告酶實驗驗證miR?208a靶向PTPRG的3'UTR

Tab.4 Double luciferase reporter assay verified the binding of miR-208a with PTPRG表4 雙熒光素報告酶實驗驗證miR-208a與PTPRG結(jié)合（n=3，x±s）

2.5過表達和敲低miR?208a對PTPRG mRNA和蛋白表達的影響qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與NC mimic組 相 比，miR?208a mimic組PTPRG的mRNA和蛋白表達均下調(diào)，mRNA水平下調(diào)約44%，蛋白水平下調(diào)約55%；而沉默miR?208a后，miR?208a inhibitor PTPRG的mRNA和蛋白分別上調(diào)3.22倍和2.22倍，見圖6，表5。

Fig.6 The effect of miR?208a overexpression and knockdown on the expression of PTPRG detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測過表達和敲低miR?208a對PTPRG蛋白表達的影響

Tab.5 The expression levels of PTPRG mRNA and protein in A549 cells after overexpression and knockdown of miR-208a表5 過表達和敲低miR-208a后A549細胞PTPRG mRNA和蛋白表達變化 （n=3，x±s）

2.6 miR?208a通過PTPRG促進A549的增殖、侵襲和遷移CCK?8實驗發(fā)現(xiàn)，與si?NC組相比，si?PTPRG組能促進A549的增殖（P＜0.01），在加入miR?208a inhibitor后，si?PTPRG的促增殖作用減弱（P＜0.05），見表6。劃痕實驗和Transwell結(jié)果顯示，與si?NC組相比，si?PTPRG組細胞遷移率升高，侵襲細胞數(shù)增多；在加入miR?208a inhibitor后，細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)較si?PTPRG組出現(xiàn)下降，見圖7、8，表7。

2.7 miR?208a靶向下調(diào)PTPRG的mRNA和蛋白表達qPCR和Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，與si?NC組相比，si?PTPRG組PTPRG mRNA和蛋白的表達水平均下 降（P＜0.01），在 加 入miR?208a inhibitor后，PTPRG的mRNA和蛋白表達水平較si?PTPRG組升高（P＜0.01）。見圖9，表8。

Tab.6 Changes of proliferation ability of A549 cells after PTPRG knockdown and miR-208a interference表6 敲低PTPRG和干擾miR-208a后A549細胞增殖能力變化（n=3，OD450，x±s）

Tab.7 Changes of migration and invasion ability in A549 cells after knockdown PTPRG and interfere with miR-208a表7 敲低PTPRG和干擾miR-208aA549細胞遷移和侵襲能力變化 （n=3，x±s）

Fig.9 Western blot results showed that the expression of PTPRG mRNA and protein were regulated by miR?208a圖9 Western blot驗證PTPRG的基因和蛋白表達量受miR?208a調(diào)控

Tab.8 The expression levels of PTPRG mRNA and protein in A549 cells after knockdown PTPRG and interfere with miR-208a表8 敲低PTPRG和干擾miR-208a后PTPRG mRNA和蛋白表達變化 （n=3，x±s）

3 討論

miRNAs在包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病中異常表達，同時也參與多種細胞的生物學(xué)過程，包括早期發(fā)育、細胞增殖、凋亡、脂肪代謝和分化等。Zou等［2］發(fā) 現(xiàn)，miR?208a能 夠 作 為 分 子 海 綿 被circRAD18吸附，從而促進三陰性乳腺癌的進展。Wu等［4］發(fā)現(xiàn)，miR?208a可通過靶向細胞程序性凋亡因子4（PDCD4）促進結(jié)腸癌的侵襲和遷移。Tang等［9］研究顯示，miR?208a能夠通過靶向p21促進人肺癌細胞增殖，增加細胞的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，miR?208a過表達可促進A549細胞增殖、侵襲和遷移，敲低miR?208a則抑制A549細胞的侵襲和遷移，與上述報道一致。提示miR?208a在NSCLC中可能作為癌基因發(fā)揮促癌作用。

Wang等［10］研究表明，miR?490?3p通過靶向TMOD3的3'UTR，抑制肝癌細胞的侵襲和遷移。Zhou等［11］研究顯示，miR?425?5p通過靶向PTEN的3'UTR，激活PI3K/AKT信號通路，促進肺癌細胞生長。本文通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PTPRG是miR?208a下游的靶基因之一。Yu等［12］研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA cMras通過調(diào)控PTPRG抑制肺腺癌的進展。Galvan等［13］發(fā)現(xiàn)PTPRG過表達能夠顯著抑制A549細胞的克隆形成。結(jié)合上述結(jié)果，筆者推測miR?208a可能通過靶向PTPRG發(fā)揮促癌作用。隨后，本研究構(gòu)建PTPRG 3'UTR野生型和突變型雙熒光素報告基因質(zhì)粒，并通過雙熒光素報告酶實驗發(fā)現(xiàn)miR?208a過表達能夠降低PTPRG 3'UTR野生型的熒光素酶活性，而干擾miR?208a表達能夠增加PTPRG 3'UTR野生型的熒光素酶活性。同時發(fā)現(xiàn)miR?208a過表達能夠降低PTPRG mRNA和蛋白的表達水平；同樣，干擾miR?208a能夠促進PTPRG mRNA和蛋白的表達水平。以上結(jié)果證實PTPRG是miR?208a的靶基因。CCK?8、Transwell侵襲實驗和劃痕實驗結(jié)果表明，干擾PTPRG能夠促進A549細胞的增殖、侵襲和遷移，這與上述文獻中PTPRG在肺癌中發(fā)揮的抑癌作用相符。在干擾PTPRG組中加入miR?208a inhibitor，則A549細胞的增殖、侵襲和遷移能力在一定程度上得到抑制。qPCR和Western blot結(jié)果顯示，miR?208a inhibitor能夠減弱PTPRG干擾處理后對PTPRG mRNA和蛋白的下調(diào)作用。以上結(jié)果證實PTPRG能夠抑制A549的增殖、侵襲和遷移，且miR?208a可以通過抑制PTPRG的表達發(fā)揮促癌作用。

綜上所述，過表達miR?208a能夠通過靶向PTPRG的3'UTR促進A549細胞的增殖、侵襲和遷移。這一研究為明確NSCLC侵襲和遷移的機制提供了一定的理論基礎(chǔ)和新的思路。

Fig.2 The effects of overexpression and knockdown of miR-208a on the migration of A549 cells detected by Scratch test圖2劃痕實驗檢測過表達和敲低miR-208a后A549細胞的遷移能力

Fig.3 The invasion ability of A549 cells after overexpression and knockdown of miR-208a detected by Transwell method(×40)圖3 Transwell實驗檢測過表達和敲低miR-208a后A549細胞的侵襲能力（×40）

Fig.7 Scratch test showed that miR-208a affects A549 migration through PTPRG圖7劃痕實驗驗證miR-208a通過PTPRG影響A549的遷移

Fig.8 Transwell experiment showed that miR-208a affected the invasion of A549 through PTPRG(×40)圖8 Transwell實驗驗證miR-208a通過PTPRG影響A549的侵襲（×40）