梁博，王新軍，王建業(yè)，周少龍，楊卓

膠質(zhì)瘤是最嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占顱腦腫瘤的30%，呈浸潤式生長，與周圍組織界限不清，導(dǎo)致手術(shù)全切后治療效果仍然不佳，且術(shù)后易發(fā)生轉(zhuǎn)移，1年生存率低于50%［1］。隨著基因診斷和基因治療的發(fā)展，尋找腫瘤發(fā)病特異性靶基因已成為研究熱點，特異性激活或抑制基因表達可抑制癌細胞增殖、侵襲、遷移，促進凋亡，從而達到治療的目的［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）普遍存在于真核細胞中，進化上高度保守，具有組織和時序特異性，人類約1/3的基因受miRNA調(diào)控，miRNA對細胞增殖、分化、遷移、侵襲、凋亡等過程有調(diào)節(jié)作用，miRNA與惡性腫瘤的關(guān)系更是受到關(guān)注［3］。miR-124在膠質(zhì)瘤中表達水平降低，與臨床分級關(guān)系密切，過表達miR-124可抑制細胞增殖和侵襲，抑制腫瘤生長和腫瘤血管新生［4］，有望成為治療靶點。趨化素樣因子超家族成員6（chemokine?like factor super family 6，CKLFSF）又稱CMTM6，在正常情況下表達較少或不表達，其在膠質(zhì)瘤中高表達可預(yù)測癌前 病 變，并 可 促 進 細 胞 癌 變［5］。但miR-124與CMTM6關(guān)系的研究尚罕見。本研究旨在觀察過表達miR-124后CMTM6表達水平的變化，并探討其對膠質(zhì)瘤細胞侵襲、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料（1）細胞系。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞SHG?44、U87、U251、A172均購自上海中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，正常膠質(zhì)細胞OLN93購自蘇州大學(xué)神經(jīng)研究所。（2）試劑及儀器。Lipofectamine 2000、pcDNA空質(zhì)粒，pcDNA+CMTM6質(zhì)粒、CMTM6?WT、CMTM6?MUT、miR-124mimic、miR-124mimic NC均購自廣州銳博生物科技有限公司；引物均由上海生工生物科技有限公司合成；RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第 一 條 鏈 合 成 試 劑 盒、2×Taq PCR MasterMix（上海TIANGEN生物技術(shù)有限公司，貨號分別為：DP419、KR104、KT201?02）；一抗兔抗CMTM6、細胞表面程序性死亡蛋白配體1（cell surface programmed death protein ligand 1，PD?L1），β?actin一抗兔抗、二抗羊抗兔，CCK?8試劑盒（英國abcam公司，貨號分別為ab264067、ab205921、ab8227、ab6721、ab228554）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：D0010）；基質(zhì)膠（美國BD公司，貨號：354234）。實時熒光定量PCR（quantitative real?time PCR，qPCR）儀（美國ABI公司，型號：7500）；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（上海Tanon科技有限公司，型號：Tanon 5200）；Transwell小室（美國Corning公司，型號：3412）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)SHG?44用10%胎牛血清RPMI?1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，U87、U251、A172均用10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，OLN93用10%胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。各細胞均置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細胞密度達85%時，收集對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 qPCR法檢測細胞中miR-124、CMTM6mRNA表達水平取2×105個/mL細胞接種至6孔板中，待細胞密度至80%，采用qPCR檢測細胞中miR-124、CMTM6mRNA表達水平。引物序列見表1。RNA提取試劑盒提取總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR上樣體系20 μL，包括2×SYBR qPCR Mix 10μL、cDNA（50 mg/L）1μL、上下游引物（10μmol/L）各0.5μL、ddH2O 8μL；反應(yīng)條件：94℃60 s；95℃30 s，60℃45 s，40個循環(huán)。2?ΔΔCt法計算miR-124、CMTM6相對表達水平。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.2.3 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗檢測細胞中CMTM6蛋白表達水平取2×105個/mL細胞接種至6孔板中，待細胞密度至85%，蛋白裂解液冰上裂解，經(jīng)4℃、10 000×g離心20 min后收集總蛋白。凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、NC膜轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應(yīng)加入一抗CMTM6（1∶100 000）、β?actin（1∶10 000），4℃孵育過夜；加入對應(yīng)羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h；DAB顯色試劑盒避光顯色，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)拍照和定量分析，Image J分析灰度值，CMTM6蛋白相對表達量=CMTM6灰度值/β?actin灰度值。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炶b定miR-124與CMTM6的靶向關(guān)系miRTarBase預(yù)測miR-124與CMTM6結(jié)合位點，將包含miR-124可能結(jié)合位點的CMTM6完整的3'UTR連接至pGL3 promotor載體，突變CMTM6與miR-124結(jié)合位點序列，得到野生型/突變型熒光素酶報告載體CMTM6?WT/CMTM6?MUT，將構(gòu)建好的CMTM6?WT/CMTM6?MUT分別與miR-124mimic或miR-124mimic NC共轉(zhuǎn)染實驗細胞，處理48 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶相對活性，驗證miR-124與CMTM6的靶向關(guān)系。

1.2.5 細胞分組及處理qPCR法擴增CMTM6（NM_017801.3）基因開放閱讀框（open reading frame，ORF），PCR純化后連接至表達載體pcDNA 3.1上，重命名為pcDNA+CMTM6；細胞接種至6孔板中，待細胞密度至70%時，參照Lipofectamine 2000說 明書 將miR-124mimic NC、miR-124mimic、pcDNA、pcDNA+CMTM6轉(zhuǎn)染于細胞中，處理6 h后更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h進行實驗。實驗分為mimic NC組、miR-124mimic組、miR-124mimic+pcDNA組、miR-124mimic+CMTM6組。

1.2.6 qPCR法檢測各組細胞中miR-124、CMTM6mRNA水平按1.2.5方法處理各組細胞，按1.2.2方法檢測細胞中miR-124、CMTM6mRNA水平。

1.2.7 CCK?8檢測各組細胞增殖情況各組細胞按密度1.0×104個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)0、24、48、72、96 h，參照CCK?8說明書操作加入CCK?8在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm下各孔細胞光密度（OD）值，每組6個復(fù)孔，實驗重復(fù)4次。

1.2.8 Transwell檢測各組細胞侵襲和遷移情況收集1.2.5處理后的各組細胞后用不含胎牛血清DMEM稀釋細胞至1.0×104個/mL，取500μL置于小室上層，小室下層加500μL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，經(jīng)95%甲醇固定15 min、0.1%結(jié)晶紫染色5 min，拍照后計數(shù)每個視野的細胞數(shù)量，檢測細胞遷移情況。每個小室選上、下、左、右、中5個視野計數(shù)，取平均值為遷移細胞數(shù)量。細胞遷移檢測中Transwell小室經(jīng)基質(zhì)膠上下包被，可檢測細胞侵襲情況。

1.2.9 劃痕實驗檢測各組細胞遷移情況按1.2.5方法處理各組細胞，待細胞密度至90%時，200μL槍頭劃痕，顯微鏡下拍照，將細胞置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，再次在顯微鏡下拍照。Image J軟件分析劃痕灰度值，遷移愈合率=（0 h灰度值?48 h灰度值）/0 h灰度值×100%。

1.2.10 Western blot實驗檢測各組細胞中CMTM6、PD?L1蛋白表達水平按1.2.5方法處理各組細胞，按1.2.3方法檢測各組細胞中CMTM6、PD?L1蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行SNK?q檢驗；不同時點多組間比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5種細胞中miR-124、CMTM6的表達情況比較與OLN93相比，SHG?44、U87、U251、A172細胞中miR-124表達水平降低，CMTM6 mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖1、表2。選擇U251細胞進行后續(xù)實驗。

Fig.1 Expressions of CMTM6 protein in 5 kinds of cells圖1 5種細胞中CMTM6蛋白的表達情況

Tab.2 Comparison of mRNA and protein levels of miR-124 and CMTM6 between five kinds of cells表2 5種細胞中miR-124、CMTM6 mRNA和蛋白表達水平比較 （n=6，x±s）

2.2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶向關(guān)系miRTarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-124與CMTM6存在結(jié)合位點，見圖2。miR-124mimic NC+CMTM6?WT、miR-124mimic+CMTM6?WT、miR-124mimic NC+CMTM6?MUT和miR-124mimic+CMTM6?MUT共轉(zhuǎn)染細胞熒光素酶相對活性分別為0.99±0.11、0.42±0.05、1.01±0.08和1.00±0.09，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=69.416，P＜0.05），其中miR-124mimic+CMTM6?WT共轉(zhuǎn)染細胞熒光素酶相對活性較miR-124mimic NC+CMTM6?WT降低（P＜0.05），而miR-124mimic NC+CMTM6?MUT與miR-124mimic+CMTM6?MUT共轉(zhuǎn)染細胞熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。證明CMTM6序列上存在miR-124特異性結(jié)合位點。

Fig.2 miRTarBase predicts the specific binding site of miR-124 and CMTM6圖2 miRTarBase預(yù)測miR-124與CMTM6的特異性結(jié)合位點

2.3miR-124對細胞中CMTM6mRNA表達水平的影響miR-124mimic組、miR-124mimic+pcDNA組細胞中miR-124表達水平高于mimic NC組和miR-124mimic+CMTM6組，CMTM6mRNA表達水平低于mimic NC組 和miR-124mimic+CMTM6組（P＜0.05），見表3。

2.4miR-124對細胞增殖的影響4組0 h時細胞OD450差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；miR-124mimic組和miR-124mimic+pcDNA組24、48、72、96 h時細胞OD450均低于mimic NC組和miR-124mimic+CMTM6組（P＜0.05），見表4。

Tab.3 Comparison of miR-124 and CMTM6 mRNA expression levels between the 4 groups表3 4組細胞中miR-124、CMTM6 mRNA表達水平比較（n=6，x±s）

2.5miR-124對細胞侵襲的影響mimic NC組、miR-124mimic組、miR-124mimic+pcDNA組、miR-124mimic+CMTM6組細胞侵襲個數(shù)分別為（53.47±4.19）、（18.69±3.17）、（17.48±4.13）、（45.67±6.16）個。miR-124mimic組 和miR-124mimic+pcDNA組 侵 襲細胞數(shù)量低于mimic NC組、miR-124mimic+CMTM6組（F=99.018，n=6，P＜0.05），見圖3。

2.6miR-124對細胞遷移的影響miR-124mimic組和miR-124mimic+pcDNA組遷移細胞數(shù)量和遷移愈合率低于mimic NC組和miR-124mimic+CMTM6組（P＜0.05），見圖4、5，表5。

2.7miR-124對細胞中CMTM6、PD?L1蛋白表達水平的影響miR-124mimic組和miR-124mimic+pcDNA組細胞中CMTM6、PD?L1蛋白表達水平低于mimic NC組 和miR-124mimic+CMTM6組（P＜0.05），見圖6、表6。

3 討論

膠質(zhì)瘤特別是腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率在顱內(nèi)腫瘤中居于首位，且近幾年發(fā)病呈年輕化趨勢；膠質(zhì)瘤細胞具有無限增殖能力，且侵襲、遷移性強，常規(guī)手術(shù)切除、放療、化療后效果不明顯，給治療造成一定困難［6］。目前靶向治療已成為研究新熱點，具有特異性強、靶向精準(zhǔn)且療效好、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢，可改善預(yù)后，提高生存率［7］。

miR-124作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量較多的miRNA，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達，可促進神經(jīng)元生成、促進海馬軸突發(fā)生和視網(wǎng)膜錐存活、調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞活化等［8］。miR-124在膠質(zhì)瘤中低表達，可參與膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等過程［9］，但其分子機制尚不完全明確。本研究結(jié)果顯示，與OLN93相比，SHG?44、U87、U251、A172細胞中miR-124表達水平降低，CMTM6 mRNA和蛋白表達水平升高，其中以在U251細胞中的作用較明顯，因此選擇在U251中驗證miR-124功能。本研究結(jié)果顯示，與mimic NC組 相 比，miR-124mimic組 和miR-124mimic+pcDNA組24、48、72、96 h時細胞OD450降低，細胞侵襲、遷移數(shù)量下降，提示miR-124在膠質(zhì)瘤中可能作為保護因子抑制細胞增殖、侵襲和遷移。miRNA作為分子靶標(biāo)，上調(diào)腫瘤抑制物miRNA水平可治療疾病，且功效較明顯［10］。miR-124在膠質(zhì)瘤中可能作為腫瘤抑制物發(fā)揮作用。有研究顯示，在視網(wǎng)膜母細胞瘤中miR-485表達明顯下調(diào)，過表達miR-485，在體外可抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、減弱細胞遷移和侵襲，在體內(nèi)可抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的生長，且miR-485可通過直接靶向Wnt3a信號通路發(fā)揮上述功能［11］。另有研究顯示，miRNA失調(diào)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進展密切相關(guān)，上調(diào)miR-524可抑制膠質(zhì)瘤細胞系的葡萄糖攝取，以及細胞增殖、遷移和侵襲，為膠質(zhì)瘤患者提供潛在治療靶點［12］。

Tab.4 Comparison of OD450 between the 4 groups表4 4組細胞OD450比較 （n=6，x±s）

Fig.5 Cell migration in 4 groups detected by scratch test圖5 劃痕實驗檢測4組細胞遷移情況

Tab.5 Comparison of cell migration between the 4 groups表5 4組細胞遷移情況比較（n=6，x±s）

Fig.6 Expressions of CMTM6 and PD?L1 proteins in the 4 groups of cells圖6 4組細胞中CMTM6、PD?L1蛋白表達情況

Tab.6 Comparison of protein levels of CMTM6 and PDL1 between the 4 groups表6 4組細胞中CMTM6、PD-L1蛋白表達水平比較（n=6，x±s）

miRNA的靶向治療可調(diào)控多種靶基因生物學(xué)功能，有望成為今后靶向治療的方向，且已應(yīng)用于多種惡性腫瘤［11］。miRTarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-124與CMTM6存在結(jié)合位點，且經(jīng)雙熒光素酶靶向關(guān)系驗證。CMTM6是一種廣泛表達蛋白，在膜蛋白轉(zhuǎn)運中發(fā)揮功能，在穿膜蛋白和分泌蛋白中起核心作用，可作為膠質(zhì)瘤的診斷指標(biāo)［12?13］。本研究結(jié)果顯示，miR-124mimic組和miR-124mimic+pcDNA組U251細胞中CMTM6 mRNA和蛋白表達水平低于mimic NC組，而miR-124mimic+CMTM6組CMTM6mRNA和蛋白表達水平高于miR-124mimic組和miR-124mimic+pcDNA組，提示miR-124可能通過CMTM6發(fā)揮抑制U251細胞增殖、遷移、侵襲的作用，驗證了miR-124可靶向CMTM6發(fā)揮功能。

有研究發(fā)現(xiàn)，CMTM6可通過穩(wěn)定PD-L1的表達而改善腫瘤患者的預(yù)后［14?15］。PD-L1作為當(dāng)前研究的熱門基因，在各種實體瘤中過度或激活表達可破壞T細胞的免疫監(jiān)視，在膠質(zhì)瘤中PD-L1過表達并與程序性死亡受體1結(jié)合產(chǎn)生免疫抑制信號，影響T細胞對腫瘤的殺傷功能，實現(xiàn)腫瘤的免疫逃逸［16］。本研究結(jié)果顯示，miR-124mimic組和miR-124mimic+pcDNA組細胞中PD?L1蛋白表達水平低于mimic NC組，miR-124mimic+CMTM6組細胞中PD?L1蛋白表達水平高于miR-124mimic組和miR-124mimic+pcDNA組，提示上調(diào)miR-124的表達可以靶向下調(diào)CMTM6的表達，降低PD?L1的穩(wěn)定表達，降低免疫抑制信號通路發(fā)揮作用，促進T細胞殺傷腫瘤細胞，抑制疾病進展。

綜上所述，高表達miR-124可下調(diào)CMTM6表達，從而下調(diào)PD?L1表達，進而抑制細胞侵襲、遷移過程，為miR-124在膠質(zhì)瘤中靶向治療提供一定參考依據(jù)。但miR-124下游存在其他靶向基因，亦可能影響膠質(zhì)瘤侵襲、遷移過程，尚待進一步研究驗證。

Fig.3 Cell invasion in 4 groups(crystal violet stain，×200)圖3 4組細胞侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×200）

Fig.4 The cell migration in the 4 groups detected by Transwell method(crystal violet stain，×200)圖4 Transwell檢測4組細胞遷移情況（結(jié)晶紫染色，×200）