【作 者】鄧敏

上海市醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，上海市，201318

0 引言

2019年12月以來，湖北省武漢市出現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎疫情，隨疫情蔓延，我國(guó)其他地區(qū)及境外多個(gè)國(guó)家也相繼發(fā)現(xiàn)此類病例。該病作為急性呼吸道傳染病已納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，按甲類傳染病管理[1]。2020年2月11日，世界衛(wèi)生組織將新型冠狀病毒肺炎命名為COVID-19，國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)的冠狀病毒研究小組建議把新型冠狀病毒命名為SARS-CoV-2（嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒）[2]。新型冠狀病毒屬于β屬的冠狀病毒，基因組為線性的單股正鏈RNA，是已知可感染人類的第7種冠狀病毒[3]，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm[1]?？梢鹑祟惡粑栏腥?，其基因特征與嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）相關(guān)冠狀病毒和中東呼吸綜合征(MERS)相關(guān)冠狀病毒有明顯區(qū)別，基因組序列約由29 kb堿基對(duì)構(gòu)成，擁有10個(gè)基因，可有效編碼10個(gè)蛋白[4]。此次由SARS-CoV-2引起COVID-19疫情具有傳染性強(qiáng)、傳播迅速等特點(diǎn)，對(duì)該病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)有利于有效控制疫情發(fā)展及對(duì)病患的及時(shí)診治。疫情爆發(fā)以來，由于時(shí)間緊迫，研發(fā)任務(wù)緊急，已上市的產(chǎn)品存在質(zhì)量上的不足。為提升試劑產(chǎn)品的性能，以便其更好地在疫情防控中發(fā)揮作用，本研究結(jié)合注冊(cè)檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)的問題，從檢驗(yàn)角度著重分析可能影響產(chǎn)品性能和質(zhì)量的把控要點(diǎn)，并提出相關(guān)建議，為今后SARS-CoV-2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)試劑的研發(fā)工作提供參考與思路。

1 新型冠狀病毒肺炎的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

目前，針對(duì)新型冠狀病毒肺炎的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要分為病原學(xué)方法及血清學(xué)方法。病原學(xué)檢測(cè)主要為核酸檢測(cè)法，檢測(cè)原理是檢測(cè)患者體液樣品中SARS-CoV-2特異性RNA序列。目前上市的核酸檢測(cè)試劑均采用新型冠狀病毒基因組中ORF1ab、E蛋白和N蛋白進(jìn)行選擇。不同產(chǎn)品的檢測(cè)原理基本一致，主要區(qū)別在于其設(shè)計(jì)的引物和探針，二重檢測(cè)的靶基因主要是雙靶區(qū)段（ORF1ab、N基因）、三重檢測(cè)的靶基因主要是三靶區(qū)段（ORF1ab、N基因和E基因）。核酸檢測(cè)方法包括基因測(cè)序法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、微滴式數(shù)字PCR法和恒溫?cái)U(kuò)增芯片法等技術(shù)。最常用的是實(shí)時(shí)熒光PCR法，具有高特異性、高靈敏度的特點(diǎn)，是一種快速、成本較低且已在臨床廣泛使用的感染性病原體核酸檢測(cè)技術(shù)。對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的操作能力、儀器設(shè)備要求較高。

血清學(xué)方法檢測(cè)原理基于免疫學(xué)抗體檢測(cè)，是檢測(cè)新型冠狀病毒進(jìn)入人體后所產(chǎn)生的特異性抗體。方法包括：免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸法及化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。已上市的抗體檢測(cè)試劑主要針對(duì)檢測(cè)抗體IgM、抗體IgG及總抗體?？贵wIgM是機(jī)體受到病原體的攻擊后人體初次體液免疫應(yīng)答出現(xiàn)的抗體，是最先產(chǎn)生并迅速到達(dá)峰值的抗體，可用于早期診斷?？贵wIgG產(chǎn)生較晚，但在血清中濃度較高、親和力水平高，存在時(shí)間久，即使患者恢復(fù)后其濃度仍可保持較高水平，可被用于提示感染處于中后期或既往感染。與核酸檢測(cè)相比，病毒抗體檢測(cè)對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室的操作要求相對(duì)要低，而且抗體血清學(xué)檢測(cè)的樣本來源于外周血、血清或血漿，具有良好的穩(wěn)定性，從而可以提高檢測(cè)的敏感度。且血液樣本更易獲得，采集操作簡(jiǎn)單快速，降低了醫(yī)護(hù)人員在樣本采集和檢測(cè)過程中被感染的概率?？贵w檢測(cè)具有速度快、通量高的特點(diǎn)，更易于在基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。但在人群流行率總體很低的情況下，病毒抗體檢測(cè)不適用于大面積復(fù)工、復(fù)產(chǎn)、復(fù)學(xué)等普通人群的篩查工作，也不適用于在低流行地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)的調(diào)查[5]。

核酸檢測(cè)病毒的RNA，是病毒存在的直接證據(jù)，而機(jī)體感染病毒后產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗體就是病毒存在間接證據(jù)，可以判斷患者是否近期或既往感染過2019新型冠狀病毒。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)（衛(wèi)健委）組織專家制定前六版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中都以病原學(xué)方法，如實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)和病毒基因測(cè)序作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。而在2020年3月3日衛(wèi)健委發(fā)布《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》（以下簡(jiǎn)稱《診療方案第七版》）中明確指出診斷標(biāo)準(zhǔn)在原有病原學(xué)方法基礎(chǔ)上，又增加“血清學(xué)檢查”作為診斷新型冠狀病毒肺炎判定的依據(jù)，即“血清新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽性”或“血清新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍以及以上升高”也可確診[1]。《診療方案第七版》中也增加疑似病例排除標(biāo)準(zhǔn)，即疑似病例排除必須滿連續(xù)兩次新型冠狀病毒核酸檢測(cè)陰性（采樣時(shí)間至少間隔24 h），且發(fā)病7 d后的新型冠狀病毒特異性抗體IgM和IgG仍然陰性[1]。病毒核酸檢測(cè)仍然是新型冠狀病毒肺炎確診感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，而抗體檢測(cè)可以作為病毒核酸檢測(cè)的有效補(bǔ)充。

2 2019新型冠狀病毒檢測(cè)試劑盒上市情況

截至2020年7月16日，已有44個(gè)新型冠狀病毒檢測(cè)試劑盒經(jīng)國(guó)家藥監(jiān)局審批上市，均為定性檢測(cè)試劑?；诓≡瓕W(xué)檢查的新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測(cè)試劑盒共計(jì)23個(gè)，其中16個(gè)熒光PCR法試劑、1個(gè)聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法試劑、1個(gè)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法試劑、1個(gè)雜交捕獲免疫熒光法試劑、1個(gè)恒溫?cái)U(kuò)增-實(shí)時(shí)熒光法試劑、1個(gè)RNA捕獲探針法試劑、1個(gè)RNA恒溫?cái)U(kuò)增-金探針層析法試劑及1個(gè)雙擴(kuò)增法試劑。新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗體檢測(cè)試劑盒共計(jì)21個(gè)，其中包括8個(gè)免疫層析試劑、11個(gè)化學(xué)發(fā)光法試劑、1個(gè)量子點(diǎn)熒光免疫法試劑、1個(gè)酶聯(lián)免疫法試劑。

3 2019新型冠狀病毒檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品性能質(zhì)量控制要點(diǎn)

2020年2月8日，科技部發(fā)布《科技部關(guān)于發(fā)布新型冠狀病毒(2019-nCoV)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)產(chǎn)品研發(fā)應(yīng)急項(xiàng)目申報(bào)指南》（后簡(jiǎn)稱《申報(bào)指南》），面向社會(huì)征集更加快速、便捷、準(zhǔn)確的新型冠狀病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)產(chǎn)品。企業(yè)紛紛響應(yīng)國(guó)家政策號(hào)召，積極參與到SARSCoV-2檢測(cè)試劑的研發(fā)生產(chǎn)活動(dòng)中來。但由于SARS-CoV-2是新發(fā)病毒，故在研發(fā)生產(chǎn)過程中存在諸多難題，如：時(shí)間緊迫、相關(guān)技術(shù)把控要點(diǎn)掌握不到位以及較難獲得足夠量的臨床樣本等。2020年2月12日，醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心發(fā)布了《2019新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審評(píng)要點(diǎn)（試行）》（簡(jiǎn)稱《核酸審評(píng)要點(diǎn)》），并在13 d后發(fā)布了《2019新型冠狀病毒抗原/抗體檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審評(píng)要點(diǎn)（試行）》（簡(jiǎn)稱《抗體審評(píng)要點(diǎn)》）。依據(jù)《審評(píng)要點(diǎn)》及其他已發(fā)布的相同方法學(xué)相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)的問題，建議企業(yè)對(duì)研發(fā)過程中可能影響產(chǎn)品性能和質(zhì)量的要點(diǎn)應(yīng)予重點(diǎn)關(guān)注，如：陽性判斷值確定、最低檢測(cè)限確定與驗(yàn)證、交叉反應(yīng)、精密度檢測(cè)方法、企業(yè)參考品的設(shè)置與制備、不同樣本類型的核酸提取方法/試劑驗(yàn)證、內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾驗(yàn)證及血液樣本滅活方式等。

3.1 核酸檢測(cè)試劑性能質(zhì)量控制要點(diǎn)

3.1.1 陽性判斷值確定資料

由于目前該類試劑盒沒有計(jì)量學(xué)溯源性，所以確定資料主要是指對(duì)申報(bào)產(chǎn)品病毒核酸檢測(cè)的Ct值（結(jié)果判斷的臨界值）進(jìn)行確認(rèn)的資料。資料中樣本來源應(yīng)考慮盡可能多的因素，并選取具有代表性的樣本。對(duì)所選擇陽性判斷值研究方法的合理性，灰區(qū)建立的基礎(chǔ)、閾值設(shè)置的科學(xué)合理性進(jìn)行闡述和驗(yàn)證。

3.1.2 最低檢測(cè)限的確定及驗(yàn)證

最低檢測(cè)限的確定及驗(yàn)證是評(píng)價(jià)產(chǎn)品性能的重要環(huán)節(jié)。因目前新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品均無量值定值，故企業(yè)在研發(fā)過程中無法通過國(guó)家參考品進(jìn)行量值溯源，這就需要企業(yè)對(duì)最低檢測(cè)限進(jìn)行合理設(shè)定及驗(yàn)證。在進(jìn)行最低檢測(cè)限的確定時(shí)，應(yīng)至少包含不同來源的三個(gè)具有代表性的2019新型冠狀病毒的真實(shí)臨床樣本或含有該病毒RNA片段的假病毒顆粒，用適當(dāng)基質(zhì)進(jìn)行系列梯度稀釋，在最低檢測(cè)限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果應(yīng)達(dá)到90%～95%陽性檢出率。采用科學(xué)的方法標(biāo)定病毒滴度，進(jìn)行最低檢測(cè)限相關(guān)的量值研究，并且提供詳細(xì)的病毒液滴度的驗(yàn)證結(jié)果。

3.1.3 交叉反應(yīng)驗(yàn)證

交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)可以直接反應(yīng)出試劑特異性方面的性能，特異性高的試劑可以減少假陽性樣本的出現(xiàn)。試劑需在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證?！逗怂釋徳u(píng)要點(diǎn)》中列舉了約50余種病毒和細(xì)菌種類，企業(yè)如無法獲得全部種類的樣本，建議至少在冠狀病毒（HKU1、OC43、NL43、229E）、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等7個(gè)大類別中分別挑選代表病毒或細(xì)菌樣本進(jìn)行驗(yàn)證。其中對(duì)于難以獲得真實(shí)樣本的類型，如SARS、MERS可用假病毒替代。需提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等相關(guān)資料。

3.1.4 精密度檢測(cè)方法

《核酸審評(píng)要點(diǎn)》中要求精密度性能驗(yàn)證需要多個(gè)臨床樣本，除模擬樣本外，同時(shí)應(yīng)包含若干臨床樣本，至少包含陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強(qiáng)）陽性樣品。精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)及注冊(cè)檢驗(yàn)過程中應(yīng)包含核酸分離/純化步驟。重復(fù)性參考品中應(yīng)包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中低濃度應(yīng)為最低檢出限附近的濃度。

3.1.5 企業(yè)參考品的設(shè)置與制備

2020年4月16日，中國(guó)食品藥品檢定研究院標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)化管理中心發(fā)布了《注冊(cè)檢驗(yàn)用體外診斷試劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品和參考品目錄（第八期）》，目錄中增加了6個(gè)新型冠狀病毒抗體、抗原及核酸檢測(cè)試劑相關(guān)的國(guó)家參考品，此批應(yīng)急用國(guó)家參考品可用于評(píng)估各申報(bào)試劑的性能，但沒有公布量值及計(jì)量溯源。

各企業(yè)應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能的實(shí)際情況，同時(shí)參照中國(guó)食品藥品檢定研究院的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品設(shè)置企業(yè)內(nèi)部參考品的項(xiàng)目及內(nèi)容，包括陽性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品、重復(fù)性參考品，且應(yīng)不低于國(guó)家參考品要求。其中，陽性參考品應(yīng)至少選取不同來源、不同滴度水平的5個(gè)病毒樣本。陰性參考品則主要包含對(duì)交叉反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證的樣本。檢測(cè)限參考品的濃度水平可等于或略高于最低檢測(cè)限的水平。企業(yè)應(yīng)對(duì)內(nèi)部參考品的來源、型別鑒定、病毒滴度等信息進(jìn)行精確的試驗(yàn)驗(yàn)證，并提交詳細(xì)的方法、使用試劑、具體數(shù)據(jù)結(jié)果等驗(yàn)證資料。除SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒可采用假病毒外，參考品應(yīng)均為臨床真實(shí)樣本。

3.1.6 不同樣本類型的核酸提取方法/試劑驗(yàn)證

目前有多種樣本類型，拭子材質(zhì)、采集方法、樣本采集量和采樣時(shí)機(jī)等都與病毒載量密切相關(guān)，可直接影響到試劑的檢出率?！对\療方案第七版》中，明確病原學(xué)檢查樣本包括：鼻咽拭子、血液、痰和其他下呼吸道分泌物、糞便等標(biāo)本[1]?！缎滦凸跔畈《靖腥镜姆窝讓?shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》中將標(biāo)本采集種類做了進(jìn)一步的細(xì)化，包括鼻咽拭子、鼻咽抽取物、呼吸道抽取物、深咳痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標(biāo)本、眼結(jié)膜拭子及便標(biāo)本，并對(duì)不同類型的樣本分別有相應(yīng)的采集及保存要求[6]。2020年7月21日，國(guó)務(wù)院應(yīng)對(duì)新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療救治組發(fā)布了《新冠病毒核酸篩查稀釋混樣檢測(cè)》中，規(guī)定原則上不超過5個(gè)的咽拭子進(jìn)行充分混合，形成混合待檢樣本。面對(duì)種類眾多的樣本類型，且包括混合樣品，這就需要企業(yè)對(duì)于上述所有樣本類型的核酸提取試劑/方法的提取效率、提取純度等，有針對(duì)性地對(duì)樣本的滅活/液化、加樣體積和模板洗脫體積做研究驗(yàn)證，明確說明具體操作過程，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。若提取過程中涉及配套使用的自動(dòng)核酸提取儀，企業(yè)還需要提供核酸提取儀的相關(guān)注冊(cè)證書、儀器使用說明書及配套提取試劑盒的使用說明書。從而確保檢測(cè)體系具有可控性，提高試劑靈敏度，降低假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，保證檢測(cè)過程順利進(jìn)行。

3.2 抗體檢測(cè)試劑性能質(zhì)量控制要點(diǎn)

抗體檢測(cè)質(zhì)量控制要點(diǎn)與核酸檢測(cè)基本一致，但考慮抗體檢驗(yàn)容易受到樣本溶血、纖維蛋白、細(xì)菌污染或患者自身抗體等因素的影響，容易造成假陽性。因此，內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾驗(yàn)證及血液樣本滅活方式對(duì)試劑的影響也需要企業(yè)進(jìn)行合理驗(yàn)證。據(jù)薛雄燕等[7]報(bào)道，采用熒光免疫分析法檢測(cè)SARS-CoV-IgM，滅活前結(jié)果為陰性的標(biāo)本，滅活處理后所有檢測(cè)結(jié)果均為陽性，陰性符合率為0，表明此方法不可采用56 ℃、30 min滅活處理后的樣本進(jìn)行檢測(cè)。說明不同的滅活方法會(huì)影響抗體檢測(cè)結(jié)果，企業(yè)應(yīng)在試劑說明書中寫明樣本滅活方法，并加以驗(yàn)證。對(duì)于同時(shí)可檢測(cè)IgM、IgG兩種抗體的檢測(cè)試劑盒，企業(yè)陽性參考品制備時(shí)要注意合理均勻分配兩種抗體陽性樣本的比例，且應(yīng)包含有IgM、IgG兩種抗體陽性的樣本，也包含有IgM、IgG單獨(dú)抗體陽性的樣本。

4 建議

2019新型冠狀病毒肺炎疫情的突發(fā)是對(duì)企業(yè)的研發(fā)能力、生產(chǎn)能力的一場(chǎng)巨大考驗(yàn)，也是對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力、安全防范的一次極大挑戰(zhàn)。疫情在全球范圍內(nèi)蔓延造成了對(duì)SARSCoV-2檢測(cè)試劑的巨大需求，研發(fā)生產(chǎn)出更加快速、便捷、準(zhǔn)確的SARS-CoV-2檢測(cè)試劑成為各個(gè)廠家研發(fā)的目標(biāo)。疫情初期，對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽性、假陰性的質(zhì)疑聲不絕于耳，但檢測(cè)過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，如：試劑質(zhì)量、采用方式、樣品質(zhì)量、操作人員、儀器性能等。應(yīng)急研發(fā)生產(chǎn)的試劑在質(zhì)量方面可能存在差異，仍有待進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證及比對(duì)。但各個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身具體情況，制定建立完整、合理和科學(xué)的技術(shù)操作規(guī)程、生物安全防護(hù)管理制度、結(jié)果質(zhì)量保證措施及結(jié)果報(bào)告的規(guī)范等，同時(shí)應(yīng)對(duì)檢測(cè)人員進(jìn)行嚴(yán)格的培訓(xùn)與考核。各個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)針對(duì)不同儀器、人員、方法和試劑開展室間質(zhì)評(píng)實(shí)驗(yàn)比對(duì)活動(dòng)，確保最終結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，以便更好地指導(dǎo)臨床診療工作。在注冊(cè)檢驗(yàn)及審批過程中應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量把控，保證檢驗(yàn)質(zhì)量，提高檢驗(yàn)效率，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，從而確保上市產(chǎn)品的質(zhì)量。隨著技術(shù)的發(fā)展與研究的深入，病毒檢測(cè)技術(shù)與方法日趨成熟完善，SARS-CoV-2檢測(cè)試劑會(huì)更好地服務(wù)于臨床，為做好常態(tài)化疫情防控工作提供強(qiáng)有力技術(shù)支撐。