樊永慧

近年來研究表明[1]，引起人類非細(xì)菌性胃腸炎的重要病原是諾如病毒，其引起嚴(yán)重的食品安全、公共衛(wèi)生問題，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)[2]，≥95%急性病毒性胃腸炎暴發(fā)，是由諾如病毒導(dǎo)致的，傳染性較高，傳播方式有：糞便-口途徑傳播、人-人之間直接傳播，嚴(yán)重影響世界公共衛(wèi)生。經(jīng)調(diào)查研究顯示[3]，腹瀉是臨床常見的消化內(nèi)科疾病，是指：與平日習(xí)慣頻率比較，排便次數(shù)增加、糞質(zhì)稀薄及水分增加等，排便量≥200 g/d，或者含有未消化食物、黏液及膿血等，患病后常有排便急迫感、肛門不適及失禁等癥狀表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，可能與病毒、細(xì)菌及寄生蟲引起腸道感染等因素有關(guān)，其中引起感染的主要病毒是GⅠ型、GⅡ型諾如病毒，因此探尋經(jīng)濟(jì)、有效及可行的檢測(cè)方法，逐漸成為醫(yī)學(xué)界研究熱點(diǎn)。張濛等[4-5]認(rèn)為，采用雙重實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR，polymerase chain reaction）法能控制疾病進(jìn)展、改善患者預(yù)后，具有操作簡(jiǎn)便、快速及特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，臨床應(yīng)用較廣泛，得到患者的青睞、認(rèn)可，基于上述背景，本研究分析腹瀉患者糞便中諾如病毒（GⅠ+GⅡ）行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)的價(jià)值，報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 基線資料

研究2019年1月—2020年3月我市人民醫(yī)院送檢的腹瀉患者的糞便標(biāo)本共400份，其中男性有210例，女性有190例，年齡41～68歲，均值（52.39±6.42）歲；體質(zhì)量19～26 kg/m2，均值是（23.29±5.47）kg/m2。（1）采集糞便的標(biāo)準(zhǔn)：腹瀉病程≥2周；排便次數(shù)≥3次/日，糞便呈稀便、水樣便、膿血便及黏液便等；患者表現(xiàn)為不同程度排便次數(shù)增加、腹痛等不適癥狀[6]；體征平穩(wěn)、意識(shí)清晰；患者知情并簽署“知情同意書”；醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：心肝腎功能障礙者；細(xì)菌性感染后的腹瀉糞便標(biāo)本；伴惡性腫瘤者；認(rèn)知、精神障礙者；臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 糞便采集 采集患者糞便標(biāo)本5～10 g，未加入任何培養(yǎng)基、試劑，等待30 min后凍存于零下20℃的冰箱，盡量≤1個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)。采用0℃冰壺運(yùn)送標(biāo)本，陽性糞便標(biāo)本：經(jīng)江蘇省句容市疾病預(yù)防控制中心復(fù)核后，確認(rèn)為諾如病毒GⅠ和GⅡ陽性的糞便樣本，采用PBS稀釋為10%病毒懸濁液，冷存于零下80℃等待檢測(cè)[7]。

1.2.2 儀器及試劑 涉及儀器有：高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma，2～16K）、熒光定量AB7500 PCR儀（美國(guó)ThermoFisher分析儀器股份公司）、病毒核酸提取試劑盒及PCR檢測(cè)試劑盒。

1.2.3 提取RNA病毒 利用病毒核酸提取試劑盒+快速柱式提取法，提取糞便標(biāo)本的病毒核酸，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 涉及試劑有：諾如病毒（GⅠ+GⅡ））雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（上海之江公司），PCR反應(yīng)按照試劑盒說明書操作，總體積是20 μl，劃分為 18 μl熒光反應(yīng)液、1 μl酶混合物和 1 μl內(nèi)部對(duì)照，將樣品RNA處理后，熒光反應(yīng)利用熒光定量PCR儀進(jìn)行。（1）條件：溫度45℃、持續(xù)10 min、反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；（2）預(yù)變性：溫度為94℃、持續(xù)2 min、進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；（3）PCR擴(kuò)增：溫度為94℃、持續(xù)15 s、進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，60℃延伸時(shí)，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行收集；（4）報(bào)告基團(tuán)：具體設(shè)置成FAM、VIC，其中GⅠ型諾如病毒采用FAM基團(tuán)監(jiān)測(cè)，GⅡ型諾如病毒采用VIC基團(tuán)監(jiān)測(cè)[8-9]。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）試驗(yàn)有效性：①試驗(yàn)有效：陰性對(duì)照的FAM、VIC通道均為陰性；②陽性對(duì)照的FAM、VIC通道均呈擴(kuò)增。

（2）FAM通道：Ct值＜38，GⅠ型諾如病毒核酸呈陽性，Ct值若顯示為無，則表示樣本呈陰性，說明GⅠ型諾如病毒核酸呈陰性，Ct值處于38～40時(shí)，表示再次進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)擴(kuò)增曲線呈擴(kuò)增，表示GⅠ型諾如病毒呈陽性，反之呈陰性。

（3）VIC通道：Ct值＜38，GⅡ型諾如病毒核酸呈陽性，Ct值若顯示為無，則表示樣本呈陰性，說明GⅡ型諾如病毒核酸呈陰性，Ct值處于38～40時(shí)，表示再次進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)擴(kuò)增曲線呈擴(kuò)增，表示GⅡ型諾如病毒呈陽性，反之表示樣本呈陰性[10]。

2 結(jié)果

本研究選擇400份腹瀉患者的糞便標(biāo)本，實(shí)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GⅠ型諾如病毒感染有15例，檢出率是3.75%；GⅡ型諾如病毒感染有59例，檢出率是14.75%；GⅠ型、GⅡ型諾如病毒混合感染有6例，檢出率是1.50%，諾如病毒的總檢出率是20.00%。

3 討論

腹瀉是臨床常見癥狀，俗稱為“拉肚子”，常因細(xì)菌性痢疾、敗潰瘍性結(jié)腸炎、血吸蟲病、病毒性腸炎及麥角性腸病等疾病引起的，具有起病急、遷延難愈及反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，發(fā)病時(shí)常有排便急迫感、肛門失禁及肛門不適等癥狀表現(xiàn)，未及時(shí)治療影響患者預(yù)后效果、甚至危及生命，因此早期合理的檢測(cè)方法，受到臨床高度重視。近年來研究表明[11-12]，諾如病毒是引起腹瀉的重要原因，傳播途徑有：食物、水源及人群接觸等，是誘導(dǎo)急性病毒性胃腸炎、食源性疾病暴發(fā)的重要原因，具體分析如下：（1）急性病毒性胃腸炎其屬于自限性疾病，患病后患者常有惡心嘔吐、腹瀉等癥狀表現(xiàn)，一般情況下呈膿血、水樣便等，一年四季均可能發(fā)病，其中秋冬季較多見，發(fā)病率較高，極易被誤診，若患者多次、大量腹瀉，引起嚴(yán)重脫水、電解質(zhì)紊亂，部分群體產(chǎn)生休克、昏迷及心跳停止等，甚至危及生命；（2）食源性疾病常見疾病類型是食物中毒，是指：食用生物性、化學(xué)性有害物質(zhì)污染的視頻，出現(xiàn)急性、亞急性食源性疾病，在氣溫較高的夏秋季發(fā)病率就較高，具體劃分成：細(xì)菌性食物中毒、非細(xì)菌性食物中毒，具有發(fā)病率高、遷延難愈等特點(diǎn)，患病后患者常表現(xiàn)為惡心嘔吐、腹瀉及腹痛等胃腸炎癥狀，未及時(shí)治療引起脫水、酸中毒及休克等，甚至危及生命，因此王強(qiáng)等[13]認(rèn)為，選擇操作簡(jiǎn)便、特異性較強(qiáng)、重復(fù)性良好及時(shí)效性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)的檢測(cè)方法迫在眉睫。

有研究報(bào)道[14]，雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)GⅠ型、GⅡ型諾如病毒具有較高的時(shí)效性，其中GⅠ型諾如病毒特異性采用Taqman探針的5’端標(biāo)記為FAM，GⅡ型諾如病毒特異性采用Taqman探針的5’端標(biāo)記為VIC，將相關(guān)標(biāo)本放置于同一反應(yīng)管，同期開展標(biāo)本檢測(cè)、分型，確保數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得諾如病毒的病原體型別、縮短檢測(cè)時(shí)間，將錯(cuò)綜復(fù)雜的檢測(cè)步驟簡(jiǎn)化，提高諾如病毒檢測(cè)效率，具備較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

經(jīng)調(diào)查研究顯示，檢測(cè)諾如病毒是疾病監(jiān)測(cè)體系的重要組成部分，回顧分析患者既往飲食調(diào)查史，結(jié)合病毒病原體檢測(cè)數(shù)據(jù)、網(wǎng)絡(luò)上報(bào)體系，實(shí)施追溯疾病誘因、傳染源，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并控制病毒引起的疾病暴發(fā)，有效治療、預(yù)防并控制諾如病毒引起的疾病，改善患者預(yù)后效果、穩(wěn)定病情。

本研究示：選擇400份腹瀉患者的糞便標(biāo)本，實(shí)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GⅠ型諾如病毒感染有15例，檢出率是3.75%；GⅡ型諾如病毒感染有59例，檢出率是14.75%；GⅠ型、GⅡ型諾如病毒混合感染有6例，檢出率是1.50%，諾如病毒總檢出率是20.00%，與陸蕓等[15-16]文獻(xiàn)結(jié)果接近。

綜上所述，腹瀉患者的糞便采用雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，為后期治療提供可靠性保障、改善預(yù)后效果。