黃麗芬，韋落落，田思思，段云波，喬自林，李 鈾，2*

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730100；

2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730030）

貴德黑裘皮羊是我國(guó)青藏高原地區(qū)藏羊的特殊經(jīng)濟(jì)類型，主要分布在我國(guó)青海省貴南縣，以產(chǎn)黑紫羔二毛皮而聞名[1]。貴德黑裘皮羊所產(chǎn)出的羔皮皮板堅(jiān)韌、輕軟、毛色烏黑發(fā)亮、毛質(zhì)細(xì)膩、毛辮不易黏結(jié)、毛卷花緊實(shí)美觀，呈環(huán)狀或半環(huán)彎曲狀，是我國(guó)裘用羊羔皮中的珍品[2]。在20 世紀(jì)80 年代中期，引進(jìn)其他品種的羊與貴德黑裘皮羊進(jìn)行雜交，導(dǎo)致品種優(yōu)質(zhì)資源純度下降，羔羊皮的品質(zhì)也隨之下降。種質(zhì)資源的下降曾一度讓貴德黑裘皮羊面臨絕種的危險(xiǎn)[3]。因此，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部多次將貴德黑裘皮羊確定為國(guó)家級(jí)遺傳資源保護(hù)品種，2014 年頒布的《中國(guó)國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》確定159 個(gè)畜禽品種為國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)品種，貴德黑裘皮羊名列其中[4]。因此，對(duì)貴德黑裘皮羊進(jìn)行群體系統(tǒng)發(fā)育的分析，對(duì)今后開(kāi)展貴德黑裘皮羊遺傳育種及資源保護(hù)和合理利用工作具有重要意義。

線粒體DNA（mtDNA）是動(dòng)物細(xì)胞唯一一種核外遺傳物質(zhì)，與核內(nèi)DNA相比，分子量較小、進(jìn)化速度較快、不與組蛋白結(jié)合而裸露并具有嚴(yán)格的母系遺傳、突變率高等特點(diǎn)。線粒體的這些特點(diǎn)對(duì)于研究動(dòng)物遺傳關(guān)系及起源進(jìn)化十分有利[5]。很多研究者對(duì)貴德黑裘皮羊進(jìn)行分子方面的研究[6-8]。其中，基于線粒體DNA的研究數(shù)量較少，且主要以線粒體D-loop 區(qū)和Cytb 基因?yàn)閿U(kuò)增對(duì)象，其他線粒體基因在貴德黑裘皮羊系統(tǒng)進(jìn)化方面的研究應(yīng)用較少[6,9]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)羊線粒體DNA 的COI 基因含有的遺傳物質(zhì)具有很強(qiáng)的系統(tǒng)解析能力，主要用于屬、種級(jí)系統(tǒng)發(fā)育的研究[10]。但還未有學(xué)者利用此基因?qū)F德黑裘皮羊進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。本研究基于線粒體COI 基因?qū)F德黑裘皮羊進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并探討其與其他品種綿羊的遺傳關(guān)系，為后續(xù)貴德黑裘皮羊的保種工作及資源合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究中使用的貴德黑裘皮羊樣本來(lái)自西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心的動(dòng)物細(xì)胞保藏庫(kù)，共選取樣本5支，樣本信息見(jiàn)表1。

表1 樣本信息Tab.1 Sample information

1.2 基因組DNA的提取及DNA濃度檢測(cè)

使用常規(guī)方法將凍存細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)后，采用通用型基因組DNA 提取試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA的提取，使用Qubit 4對(duì)所提取的基因組DNA進(jìn)行濃度檢查。

1.3 引物與PCR擴(kuò)增

以Genbank中綿羊mtDNA（序列號(hào)為AF010406）全序列為基礎(chǔ)，進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。所設(shè)計(jì)的上游引物為COIF（5'-ACAGTCGGAATAGACGTCGA-3'），下 游 引 物 為COIR（5'-GGTTCTTCAAATGTGTGGTATGG-3'）。引物由寶生物工程（大連）公司合成。利用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)貴德黑裘皮羊進(jìn)行線粒體COI基因序列的擴(kuò)增。試驗(yàn)前，通過(guò)不斷的試驗(yàn)，建立最佳的PCR 擴(kuò)增體系，此次擴(kuò)增體系（25 μL）：上下游引物為0.5 μL 和10 μmol/L、DNA 2 μL、2×Pro Taq Master Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；最后72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳，在136 V 電壓下跑膠30 min 進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)合格的擴(kuò)增產(chǎn)物送蘭州天啟基因生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

獲得測(cè)序結(jié)果用Geneious 11.0.4 處理原始測(cè)序文件，將2 條序列的波峰進(jìn)行拼接得到比較完整序列的波峰圖，并對(duì)完整的樣本序列波峰圖進(jìn)行校對(duì)，最終生成Fasta 文件格式獲得單個(gè)樣本的完整序列。所得貴德黑裘皮羊COI 基因序列與Genbank 上已發(fā)表的其他綿羊品種的COI 基因序列用MEGA-X 處理，所用綿羊品種信息見(jiàn)表2。

表2 Genbank上已發(fā)表的綿羊品種信息Tab.2 Sheep breed information published on the Genbank

計(jì)算貴德黑裘皮羊種內(nèi)及貴德黑裘皮羊與其他綿羊品種間的遺傳距離，構(gòu)建ML進(jìn)化樹(shù)、NJ進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。選用p-disdtance作為模型構(gòu)建NJ進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行遺傳距離的計(jì)算。運(yùn)用MEGA軟件中的MODELS功能對(duì)構(gòu)建ML 進(jìn)化樹(shù)的最佳模型進(jìn)行計(jì)算。通過(guò)計(jì)算，查看序列數(shù)據(jù)的BIC值（BIC值表示的是模型對(duì)數(shù)據(jù)的解釋度，BIC值越小則表示模型對(duì)數(shù)據(jù)的解釋力越強(qiáng)），并選取BIC值最低的模型作為最佳模型進(jìn)行ML樹(shù)的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI基因擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果

將檢測(cè)合格的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送由蘭州天啟基因生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增序列長(zhǎng)度合適，為所擴(kuò)增目標(biāo)基因序列，經(jīng)過(guò)序列拼接校對(duì)后得到的序列長(zhǎng)度均為622 bp，整理后的結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)GD-3 樣本在622 bp處發(fā)生單核苷酸變異，堿基A突變?yōu)閴A基T，其他樣本序列均未發(fā)生突變。

2.2 貴德黑裘皮羊基于COI基因系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA將經(jīng)Geneious11.0.4軟件拼接校對(duì)后的貴德黑裘皮羊COI序列與在GenBank上下載的52個(gè)序列，用鄰近法（見(jiàn)圖1）和最大似然法（見(jiàn)圖2）進(jìn)行貴德黑裘皮羊系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建。

圖1 NJ系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree

圖2 ML系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.2 Maximum Likelihood phylogenetic tree

由圖1 可知，基于COI 基因用鄰近法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)可看出貴德黑裘皮羊品種之間，樣本GD-1、GD-4、GD-5距離較近，樣本GD-2和GD-3與其他3個(gè)樣本距離較遠(yuǎn)，但都聚在同一支上。同時(shí)，試驗(yàn)選用的5個(gè)貴德黑裘皮羊樣本個(gè)體COI 基因序列與烏珠穆沁羊、灘羊、青海藏羊、塔什庫(kù)爾干羊等18個(gè)品種的羊聚為一支，說(shuō)明所試驗(yàn)貴德黑裘皮羊與這18個(gè)綿羊品種有較近的親緣關(guān)系；也說(shuō)明所采集到的貴德黑裘皮羊樣本有可能與這18個(gè)親緣關(guān)系較近的品種的羊存在基因流。結(jié)果顯示，貴德黑裘皮羊與蒙古盤羊、西藏盤羊、芬蘭綿羊等34個(gè)國(guó)際羊的品種沒(méi)有聚在同一支上，有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。其中，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是蒙古盤羊、西藏盤羊。

基于COI基因序列先運(yùn)用MEGA軟件中MODELS功能計(jì)算，找到構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的最佳模型Tamura 3-parameter，進(jìn)而利用最大似然法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。由圖2可知，結(jié)果與鄰近法所建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)結(jié)果相差不大，顯示貴德黑裘皮羊樣本仍與烏珠穆沁羊、灘羊、青海藏羊等18 個(gè)國(guó)際上的綿羊品種聚為一支，樣本GD-2與樣本GD-1、GD-4、GD-5距離較近，樣本GD-3卻與其他4個(gè)樣本有一定差異，說(shuō)明該樣本與其他綿羊品種存在基因流，可能是品種間雜交導(dǎo)致。

3 討論

mtDNA 在生物體內(nèi)會(huì)隨著線粒體獨(dú)立復(fù)制，不受核基因影響，不與組蛋白結(jié)合而裸露，具有嚴(yán)格的母系遺傳特點(diǎn)，且拷貝數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于核DNA。核基因會(huì)隨著待檢樣本的變質(zhì)腐蝕而降解，但樣本仍可通過(guò)PCR 擴(kuò)增技術(shù)對(duì)mtDNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，且與核基因相比，mtDNA擴(kuò)增更容易[11]。mtDNA 較核基因有較低的突變率，mtDNA 在一些區(qū)段變異較快，而基于母系遺傳的特點(diǎn)在另一區(qū)段可能相對(duì)保守。同時(shí)，母系遺傳的特點(diǎn)使其不受外來(lái)雜交公畜基因的影響，并且保留好進(jìn)化過(guò)程中的變異位點(diǎn)，能夠在系統(tǒng)進(jìn)化研究中更好地提供遺傳材料[12]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)mtDNA 的COI 基因含有的遺傳物質(zhì)具有很強(qiáng)的系統(tǒng)解析能力，適用于屬、種間的遺傳進(jìn)化關(guān)系研究，有不少研究利用其進(jìn)行物種遺傳進(jìn)化的研究并取得一定成果。徐浩文等[13]經(jīng)過(guò)對(duì)8個(gè)地理種群紅條毛膚石鱉COI基因進(jìn)行擴(kuò)增研究遺傳多樣性，得到南方與北方的紅條毛膚石鱉群體遺傳多樣性存在差異，應(yīng)該對(duì)2個(gè)地區(qū)的紅條毛膚石鱉分別進(jìn)行相對(duì)應(yīng)的保護(hù)措施。趙慶等[14]利用COI 基因分析我國(guó)重要的貝類之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，研究表明，COI 基因能對(duì)不同區(qū)域的同一種群進(jìn)行聚類，驗(yàn)證COI基因在物種系統(tǒng)進(jìn)化研究中的可行性。但是，目前尚未見(jiàn)到對(duì)貴德黑裘皮羊進(jìn)行COI基因擴(kuò)增研究其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的報(bào)道。

因此，本次試驗(yàn)經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，選取PCR 最優(yōu)反應(yīng)體系對(duì)貴德黑裘皮羊線粒體DNA的COI基因進(jìn)行擴(kuò)增。因核苷酸序列數(shù)據(jù)屬于性狀數(shù)據(jù)，不能夠通過(guò)核苷酸序列來(lái)研究物種的進(jìn)化距離，所以得到的擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)測(cè)序及Geneious11.0.4軟件校對(duì)處理后需要用軟件將核苷酸序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為種群個(gè)體之間的距離值，再進(jìn)行分析[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，貴德黑裘皮羊樣本之間均聚為一支，但GD-3與其他樣本GD-1、GD-2、GD-4、GD-5 有一定的親緣距離。同時(shí)，在參與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建的GenBank 上下載的52 個(gè)品種羊中，與貴德黑裘皮羊聚為一支的共有18 個(gè)品種，與貴德黑裘皮羊有較近的親緣關(guān)系，可以初步判斷所采集貴德黑裘皮羊樣本有可能與國(guó)際上其他綿羊品種進(jìn)行了雜交，且樣本GD-3 個(gè)體與其他親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)品種的羊進(jìn)行了雜交。其余34個(gè)國(guó)際上的綿羊品種都沒(méi)有與貴德黑裘皮羊品種聚為一支，與貴德黑裘皮羊有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，其中親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的是蒙古盤羊和西藏盤羊。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，貴德黑裘皮羊種質(zhì)資源的保護(hù)應(yīng)避免其與其他綿羊品種之間的基因流。未來(lái)研究工作應(yīng)利用多基因、多手段的分析方法，系統(tǒng)、全面地揭示貴德黑裘皮羊種群遺傳情況與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為其種質(zhì)資源遺傳保護(hù)提供可靠的參考依據(jù)。