周向宇 潘 坤 劉 杰 王鋒尖*

（1漢江師范學院化學與環(huán)境工程學院，湖北十堰 442000；2 十堰市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，湖北十堰 442000）

全世界約有側(cè)耳屬50種，目前我國包括野生及引種栽培的已知種類為36種，是側(cè)耳屬真菌種類資源較為豐富的國家之一[1]。肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）屬于蘑菇綱（Agaricomycetes）、蘑菇目（Agaricales）、側(cè)耳科（Pleurotaceae）、側(cè)耳屬（Pleurotus）[2]，我國廣東、廣西、河南、吉林、陜西、西藏、新疆等?。▍^(qū)）均有分布，夏季生長在枯死的闊葉樹或倒木上[3]。研究表明，肺形側(cè)耳多糖具有抗癌活性[4]。目前肺形側(cè)耳已被列入第十一批《中華人民共和國農(nóng)業(yè)植物品種保護名錄》[5]。肺形側(cè)耳子實體形態(tài)受環(huán)境影響較大，從牛頭山采集的子實體形態(tài)與文獻報道[3，6-8]存在一定差異，故對其進行分離培養(yǎng)及出菇試驗，為開發(fā)利用該菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試肺形側(cè)耳菌株

圖1 野生肺形側(cè)耳子實體

野生肺形側(cè)耳子實體（圖1）于2015年采自湖北省十堰市牛頭山國家森林公園，采集人王鋒尖，采集時間2015 年9 月19 日，采集地東經(jīng)110°43′，51.7″、北緯32°36′04.7″，海拔439 m。采集標本存放于漢江師范學院真菌標本室（HMHNU），標本號HMHNU1049。菌株由子實體組織分離得到，保存于漢江師范學院菌種庫。該菌株由漢江師范學院王鋒尖根據(jù)宏觀形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)特征初步鑒定為肺形側(cè)耳。經(jīng)ITS序列分析（圖2），并在Gen Bank運用Blast進行同源性比對，得出，與側(cè)耳屬的肺形側(cè)耳最大同源性高達99.84%，結(jié)合宏觀形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)鑒定為肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）。

圖2 采集野生肺形側(cè)耳菌株的ITS區(qū)域堿基序列

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)溫度試驗

培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L［9］。

取7 mm菌塊接入上述培養(yǎng)基平皿正中，每組4個平行，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。參照高洋等[10]的方法，每天觀察菌絲長勢，測量菌絲生長量，計算菌絲平均生長速度。

1.2.2 培養(yǎng)基pH試驗

培養(yǎng)基配方同1.2.1。分別用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸堿度，pH 分別為5、6、7、8、9，共5 組，每組4 個平行。接種后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌絲生長考察方法同1.2.1。

1.3 碳源試驗

試驗用碳源分別為葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、淀粉。培養(yǎng)基中其他成分同溫度試驗，每組4個平行。接種后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌絲生長考察方法同1.2.1。

1.4 氮源試驗

試驗用氮源分別為酵母浸粉、尿素、蛋白胨、硝酸銨。培養(yǎng)基中其他成分同溫度試驗，每組4 個平行。接種后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌絲生長考察方法同1.2.1。

1.5 栽培試驗

栽培料配方為：木屑68%，棉籽殼20%，麩皮10%，白砂糖1%，石膏粉1%。料含水量為60%～65%。

取15 cm×30 cm 聚丙烯袋，裝入攪拌均勻的濕料約800g。共4 袋，121 ℃滅菌2 h。取5 個7 mm的菌塊接入料袋，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌絲長滿袋后，移入溫室大棚，溫度20～25 ℃、空氣相對濕度95%催蕾。記錄菌絲長勢、菌絲長滿菌袋的天數(shù)，采收子實體，計算生物學效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對試驗肺形側(cè)耳菌株菌絲生長的影響

由表1 可知，試驗肺形側(cè)耳菌株菌絲在15～40 ℃均可生長。不同試驗溫度的菌絲平均生長速度排序：25 ℃＞30 ℃＞35 ℃＞20 ℃＞40 ℃＞15 ℃。不同溫度培養(yǎng)的菌絲生長速度均呈現(xiàn)出顯著性差異。培養(yǎng)溫度為25 ℃、30 ℃時菌絲長勢濃密?？梢娫谠囼灉囟确秶鷥?nèi)25 ℃為該肺形側(cè)耳菌株菌絲培養(yǎng)最適溫度，30 ℃次之。

表1 培養(yǎng)溫度對試驗肺形側(cè)耳菌株菌絲生長的影響

2.2 pH對試驗肺形側(cè)耳菌株菌絲生長的影響

由表2 可知，在pH5～9 培養(yǎng)基上試驗肺形側(cè)耳菌株菌絲均可生長，供試pH 間菌絲平均長速有差異。試驗pH 培養(yǎng)基上菌絲平均長速排序：pH6＞pH7＞pH8＞pH9＞pH5。pH6 與pH5，pH7 與pH5，pH8與pH5，pH6 與pH8，pH6 與pH9，pH7 與pH9 培養(yǎng)基中的菌絲平均長速有顯著的差異，pH6 與pH7 培養(yǎng)基中的菌絲平均長速差異不顯著。所有菌絲長勢均較密?？梢娫谠囼瀙H 范圍內(nèi)，培養(yǎng)基最適pH 為6～7。

表2 pH對試驗肺形側(cè)耳菌株菌絲生長的影響

2.3 供試碳源對試驗肺形側(cè)耳菌株菌絲生長的影響

由表3 可知，試驗肺形側(cè)耳菌株在試驗用5 種碳源培養(yǎng)基上菌絲均可生長，不同碳源的培養(yǎng)基上菌絲平均長速有差異。試驗碳源培養(yǎng)基上菌絲生長速度排序：淀粉＞蔗糖＞甘露醇＞葡萄糖＞乳糖。蔗糖與甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上菌絲平均長速差異不顯著。淀粉與其他4 種碳源，蔗糖與乳糖、葡萄糖，甘露醇與葡糖糖、乳糖，葡萄糖與乳糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲平均長速差異顯著；乳糖為碳源培養(yǎng)基上菌絲相比其他碳源稀疏。可見試驗最適碳源為淀粉，蔗糖、甘露醇次之。

表3 供試碳源對試驗肺形側(cè)耳菌株菌絲生長的影響

2.4 供試氮源對試驗肺形側(cè)耳菌株菌絲生長的影響

由表4 可知，試驗肺形側(cè)耳菌株在供試氮源培養(yǎng)基上菌絲均可生長，不同氮源的培養(yǎng)基上菌絲平均長速有差異。試驗氮源培養(yǎng)基上菌絲平均長速排序：蛋白胨＞酵母浸粉＞硝酸銨＞尿素。蛋白胨與酵母浸粉為氮源的培養(yǎng)基上菌絲平均長速差異不顯著，硝酸銨與尿素，蛋白胨與尿素，酵母浸粉與尿素為氮源的培養(yǎng)基上菌絲平均長速均呈顯著性差異；硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲比其他氮源稀疏。蛋白胨為試驗最佳氮源。

表4 供試氮源對試驗肺形側(cè)耳菌株菌絲生長的影響

2.5 栽培結(jié)果

栽培袋接種28 d 后菌絲長滿袋，繼續(xù)培養(yǎng)3d后形成原基，5 d 后形成子實體，即可采摘（圖3）。第一潮子實體鮮重268.5 g，在50 ℃條件下烘干至恒重，得到子實體干重39.6 g，生物學效率為86.06%。肺形側(cè)耳野生子實體與人工袋栽子實體形態(tài)存在顯著差異，應為野生環(huán)境刺激肺形側(cè)耳子實體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖3 人工栽培的肺形側(cè)耳子實體（左為背面，右為正面）

3 小結(jié)

野生肺形側(cè)耳菌株分離培養(yǎng)菌絲體結(jié)果表明，該菌株菌絲體最適生長條件：培養(yǎng)溫度為25 ℃、培養(yǎng)基pH6～7、碳源為淀粉、氮源為蛋白胨。菌絲培養(yǎng)最適溫度、最適pH、最適氮源與蘭玉菲等[11]、鐘麗娟等[12]、王廣維等[13]結(jié)果較為一致。尿素作為唯一氮源時菌絲可以生長，與鐘麗娟等[12]、王廣維等[13]試驗結(jié)果不同。最適碳源與王廣維等[13]獲得結(jié)果一致，與蘭玉菲等[11]、鐘麗娟等[12]得到的結(jié)果不同。試驗結(jié)果與前人研究有差異，可能與供試菌株以及基礎培養(yǎng)基配方差異有一定關系。

人工栽培長出的子實體與野生標本子實體形態(tài)存在顯著差異，更具觀賞性。