徐先立 韓壯 張忠文

1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院骨科，沈陽 110866；2 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽110001

骨壞死是一種比較常見的骨科疾病，指由于循環(huán)障礙導(dǎo)致的骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞缺血性死亡［1］。糖皮質(zhì)激素（GCs）是廣泛用于治療炎癥或自身免疫性疾病的藥物，包括關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和嚴(yán)重過敏反應(yīng)［2］。近年來，大量研究表明過量使用GCs 會(huì)抑制成骨細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，從而導(dǎo)致患者發(fā)生非創(chuàng)傷性骨壞死［3-4］。長期接受GCs治療的患者骨折發(fā)生率為30%～50%［5］。因此，探討GCs介導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制至關(guān)重要，這可能有助于開發(fā)緩解GCs 誘導(dǎo)骨壞死的有效治療方法。Dex 是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，可用于治療紅斑狼瘡、牛皮癬、過敏性疾病和慢性阻塞性肺疾病等多種疾?。?］。Sato AY等［7］的研究指出活性氧/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ROS/ER）與Dex 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡有關(guān)。但仍需更多的研究來進(jìn)一步探索Dex 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。在本研究中，我們旨在研究ROS 在Dex 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡中的作用，為進(jìn)一步了解Dex 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供可能的思路，并為減輕Dex 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷和骨壞死提供可能的治療靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨細(xì)胞株hFOB 1.19 購自美國ATCC 細(xì)胞保藏中心。hFOB 1.19細(xì)胞為人胚永生化成骨細(xì)胞系，是將SV40 LT 抗原基因轉(zhuǎn)染入自然流產(chǎn)的胎兒組織中使其獲得永生化的，與人成骨細(xì)胞具有高度同源性，是評價(jià)藥物影響骨代謝的最佳細(xì)胞模型。將細(xì)胞培養(yǎng)在Ham"s F12和DMEM 1∶1的混合培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞干預(yù)及分組 細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶（上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：2.5萬U）消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為 5×103個(gè)/ml，每孔 200 μl 種植于 96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后吸棄培養(yǎng)液，加入0、1、5、25、50、100、200 和300 μM的Dex（美國Sigma-Aldrich 公司），加入培養(yǎng)基至200 μl，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，之后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖率。

為檢測ROS 在Dex 影響成骨細(xì)胞增殖及凋亡中的作用，我們采用ROS 的清除劑抗壞血酸（AA）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）處理Dex（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：075 mg）干預(yù)后的成骨細(xì)胞，AA 和NAC 均購自美國Sigma-Aldrich 公司。基于此，將 hFOB 1.19 分為 4 組：對照組，Dex 組，Dex+AA 組和 Dex+NAC 組。對照組：不加藥物，只培養(yǎng) 48 h；Dex 組：細(xì)胞采用 300 μM 的 Dex 處理 48 h。Dex+AA 組：細(xì)胞中同時(shí)加入 300 μM 的 Dex 及 2 000 μM 的AA，培養(yǎng) 48 h。Dex+NAC 組：細(xì)胞中同時(shí)加入 300 μM 的Dex及500 μM的NAC，培養(yǎng)48 h。

1.3 細(xì)胞增殖率檢測 將5×103個(gè)/ml密度的細(xì)胞以每孔 200 μl 種植于 96 孔板中，細(xì)胞干預(yù)及分組同 1.2 部分，均以只含有培養(yǎng)基的孔為空白孔。處理48 h 后每孔加入10 μl 的CCK-8 溶液，于37℃孵育 1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 處 檢測 吸 光值（OD）。 細(xì) 胞增 殖 率（%）=（OD試驗(yàn)組-OD空白組）/OD空白組×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡率檢測 細(xì)胞分組同1.2部分，培養(yǎng)48 h后用 PBS 洗 3 次。然后將 100 μl 的細(xì)胞加入至 100 μl 的FITC-Annexin V/PI 檢測液中，避光室溫孵育30 min。之后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 ROS 水平檢測 細(xì)胞分組同1.2 部分，培養(yǎng)48 h后用 PBS 洗 3 次，然后用 10 μM 的 DCFH-DA 于 37℃避光孵育30 min，之后采用流式細(xì)胞儀檢測平均熒光強(qiáng)度。活性氧檢測試劑盒購自上海碧云天公司，嚴(yán)格按照試劑盒操作。

1.6 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測 細(xì)胞分組同1.2 部分，培養(yǎng) 48 h 后。取 10 μl 的細(xì)胞加入 96 孔板中，用堿性磷酸酶檢測試劑盒（上海碧云天公司）中的顯色底物調(diào)整體積至50 μl，搖晃均勻，于37℃孵育10 min。之后每孔加入 100 μl的反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀在405 nm 處檢測吸光值。ALP 活性單位的定義為：在pH 9.8 的二乙醇胺（DEA）緩沖液中，37℃條件下，每分鐘水解對硝基苯磷酸二鈉顯色底物產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需的ALP 的量定義為一個(gè)酶活力單位，也稱為一個(gè)DEA 酶活力單位。ALP 活性（%）=ALP 活性單位給藥組/ALP活性單位對照組×100%。

1.7 Western Blot 細(xì)胞分組同1.2 部分，培養(yǎng)48 h 后采用RIPA 裂解液提取各組細(xì)胞中的總蛋白，BCA 試劑盒對總蛋白定量。將20 μg的總蛋白加入至上樣緩沖液中，采用SDS-PAGE 凝膠電泳分離總蛋白，之后將總蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。采用3%胎牛血清封閉45 min后，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗 3 次。孵育二抗，室溫?fù)u床孵育 1 h，TBST 洗3 次。用電化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）于暗室發(fā)光。凝膠成像系統(tǒng)和Image J軟件收集處理分析條帶，GAPDH為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組建比較采用單因素方差分析，LSD 多重比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Dex對成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響 如圖1所示，與0 μM 的Dex對比，100 μM、200 μM 和300 μM 的Dex可顯著抑制成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖率（均P＜0.05）。而且Dex 的半抑制濃度（IC 50）約在300 μM，因此我們選擇300 μM 的Dex應(yīng)用于后續(xù)的試驗(yàn)。如表1所示，與對照組對比，Dex組細(xì)胞的細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）。與 Dex 組對比，Dex+AA 組和 Dex+NAC 組細(xì)胞的細(xì)胞增殖率顯著增加（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

2.2 Dex對成骨細(xì)胞中ROS和ALP 水平的影響 如表2 所示，與對照組對比，Dex 組細(xì)胞的ROS 水平顯著增加（P＜0.05），ALP 活性顯著降低（P＜0.05）。與 Dex 組對比，Dex+AA組和Dex+NAC組細(xì)胞的ROS水平顯著降低（均P＜0.05），ALP活性顯著增加（均P＜0.05）。

2.3 Dex 對成骨細(xì)胞中PI3K 活性的影響 如表3 所示，與對照組對比，Dex 組細(xì)胞的p-PI3K 相對表達(dá)量和p-PI3K/PI3K 比值顯著降低（P＜0.05）。與 Dex 組對比，Dex+AA 組和Dex+NAC 組細(xì)胞的p-PI3K 相對表達(dá)量和p-PI3K/PI3K 比值顯著增加（P＜0.05）。各組間PI3K 相對表達(dá)量對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Dex對成骨細(xì)胞增殖率的影響

表1 各組細(xì)胞增殖率和細(xì)胞凋亡率對比（±s，%）

表1 各組細(xì)胞增殖率和細(xì)胞凋亡率對比（±s，%）

注：與對照組對比，aP＜0.05；與Dex組對比，bP＜0.05

組別對照組Dex組Dex+AA組Dex+NAC組F值P值細(xì)胞增殖率100.00±1.76 51.47±5.62a 89.32±6.74b 94.58±5.01b 44.82＜0.001細(xì)胞凋亡率3.71±1.16 18.42±3.19a 9.68±2.23ab 8.97±2.07ab 28.61＜0.001

表2 各組細(xì)胞中ROS和ALP水平對比（±s）

表2 各組細(xì)胞中ROS和ALP水平對比（±s）

注：與對照組對比，aP＜0.05；與Dex組對比，bP＜0.05

組別對照組Dex組Dex+AA組Dex+NAC組F值P值熒光強(qiáng)度1.49±0.37 4.40±1.08a 2.05±0.61b 1.96±0.43b 14.68 0.003 ALP活性（%）100.00±0.83 69.71±7.53a 85.49±8.17ab 92.55±8.01b 14.09 0.002

表3 各組細(xì)胞中PI3K活性對比（±s）

表3 各組細(xì)胞中PI3K活性對比（±s）

注：與對照組對比，aP＜0.05；與Dex組對比，bP＜0.05

組別對照組Dex組Dex+AA組Dex+NAC組F值P值PI3K相對表達(dá)量0.57±0.13 0.62±0.16 0.63±0.11 0.59±0.14 0.16 0.92 p-PI3K相對表達(dá)量0.98±0.17 0.26±0.08a 0.76±0.12b 0.80±0.12b 23.76＜0.001 p-PI3K/PI3K 1.72±0.35 0.43±0.10a 1.21±0.27b 1.35±0.21b 18.89＜0.001

2.4 Dex 對成骨細(xì)胞中AKT 活性的影響 如表4 所示，與對照組對比，Dex 組細(xì)胞的p-AKT 相對表達(dá)量和p-AKT/AKT 比值顯著降低（P＜0.05）。與Dex 組對比，Dex+AA 組和Dex+NAC 組細(xì)胞的p-AKT 相對表達(dá)量和p-AKT/AKT 比值顯著增加（P＜0.05）。各組間AKT 相對表達(dá)量對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 各組細(xì)胞中AKT活性對比（±s）

表4 各組細(xì)胞中AKT活性對比（±s）

注：與對照組對比，aP＜0.05；與Dex組對比，bP＜0.05

組別對照組Dex組Dex+AA組Dex+NAC組F值P值A(chǔ)KT相對表達(dá)量0.85±0.21 0.86±0.19 0.88±0.23 0.94±0.16 0.16 0.92 p-AKT相對表達(dá)量0.56±0.10 0.19±0.06a 0.38±0.11b 0.42±0.08b 11.61 0.007 p-AKT/AKT 0.66±0.19 0.21±0.08a 0.45±0.04b 0.45±0.07b 11.04 0.001

2.5 Dex 對成骨細(xì)胞中GSK3β 活性的影響 如表5 所示，與對照組對比，Dex 組細(xì)胞的GSK3β 相對表達(dá)量、p-GSK3β 相對表達(dá)量和 p-GSK3β/GSK3β 比值均顯著增加（P＜0.05）。與Dex 組對比，Dex+AA 組和細(xì)胞的 p-GSK3β相對表達(dá)量和p-GSK3β/GSK3β 比值顯著降低（P＜0.05），GSK3β相對表達(dá)量無顯著變化。

表5 各組細(xì)胞中GSK3β活性對比（±s）

表5 各組細(xì)胞中GSK3β活性對比（±s）

注：與對照組對比，aP＜0.05；與Dex組對比，bP＜0.05

組別對照組Dex組Dex+AA組Dex+NAC組F值P值GSK3β相對表達(dá)量0.18±0.05 0.37±0.06a 0.31±0.08 0.30±0.06 6.29 0.008 p-GSK3β相對表達(dá)量0.12±0.04 0.49±0.09a 0.26±0.05ab 0.22±0.07b 22.92＜0.001 p-GSK3β/GSK3β 0.67±0.15 1.32±0.24a 0.83±0.19b 0.73±0.16b 9.87 0.002

3 討 論

骨壞死是一種嚴(yán)重的退化性骨疾病，與成骨細(xì)胞凋亡有關(guān)［1］。成骨細(xì)胞是一種骨形成細(xì)胞，在骨生成和預(yù)防骨壞死中起關(guān)鍵作用［8］。GCs 的使用已成為骨壞死的最常見原因［3］。先前的研究已經(jīng)證明，Dex對成骨細(xì)胞具有抑制作用，原因與其對成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)［9］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)100 μM、200 μM 和300 μM 的Dex 作用48 h 可顯著抑制成骨細(xì)胞hFOB 1.19 的細(xì)胞增殖，且 Dex 的 IC 50 約在 300 μM，因此我們選擇 300 μM 的 Dex應(yīng)用于后續(xù)的試驗(yàn)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，300 μM 的Dex 作用48 h可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果及研究均表明，Dex可抑制成骨細(xì)胞的增肌，并促進(jìn)其凋亡。

過量的ROS 在誘導(dǎo)各種細(xì)胞凋亡中具有重要的作用［10］。過量的 ROS 產(chǎn)生將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) ROS 壓力增加，然后破壞細(xì)胞中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 的結(jié)構(gòu)和功能，從而通過線粒體介導(dǎo)的caspase 凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11］。Sato AY等［7］的研究證明ROS應(yīng)激的增加參與Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞OB-6 凋亡。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)Dex 可顯著增加成骨細(xì)胞中ROS的水平約3倍，推測這可能是Dex誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制。因此之后我們采用ROS 的清除劑NAC 或AA 與Dex 同時(shí)處理成骨細(xì)胞，結(jié)果表明NAC 或AA 均可降低Dex誘導(dǎo)的ROS 的產(chǎn)生，驗(yàn)證了NAC 或AA 對ROS 的清除效果。此外，我們還發(fā)現(xiàn)NAC或AA可增加Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖，并抑制Dex 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，Dex 對成骨細(xì)胞的促凋亡作用是通過過量ROS 的產(chǎn)生介導(dǎo)的。

ALP 可使局部鈣、磷的濃度升高，并在膠原原纖維內(nèi)沉積，對礦物質(zhì)化機(jī)制的進(jìn)行具有有利的作用，是促進(jìn)骨間質(zhì)礦化的重要酶。目前認(rèn)為ALP活性是反映成骨細(xì)胞成熟狀態(tài)的重要標(biāo)志之一［12］。本研究結(jié)果顯示，與對照組對比，Dex 組細(xì)胞的ALP 活性顯著降低。與Dex 組對比，Dex+AA組和Dex+NAC 組細(xì)胞的ALP 活性顯著增加。這些結(jié)果表明，Dex 可降低成骨細(xì)胞的活性，而在Dex 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中加入ROS 清除劑后可顯著增加成骨細(xì)胞的活性，進(jìn)一步表明ROS在Dex抑制成骨細(xì)胞活性中的重要作用。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶3（PI3K/AKT）信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化、侵襲和凋亡相關(guān)的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［8］。Ma P 等［13］的研究指 PI3K/AKT 信號(hào)通路的激活是大鼠成骨細(xì)胞增殖和分化的必要條件。在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)Dex 處理可下調(diào)成骨細(xì)胞hFOB 1.19 中p-PI3K 和 p-AKT 的表達(dá)，而 NAC 或 AA 可逆轉(zhuǎn) Dex 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中PI3K/AKT 信號(hào)通路的失活。這些結(jié)果證實(shí)了Dex 通過抑制PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，并且ROS 應(yīng)激的增強(qiáng)在Dex 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中PI3K/AKT 信號(hào)通路的失活中起重要作用。

糖原合成酶激酶3β（GSK3β）最初被認(rèn)為是糖原代謝的調(diào)節(jié)劑［14］。GSK3β 是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以調(diào)節(jié)能量代謝、細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡［15］。此外，GSK3β是PI3K/AKT 的關(guān)鍵下游底物和效應(yīng)子［16］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，Dex 可增加成骨細(xì)胞中 GSK3β 的活性，而 NAC 或 AA可逆轉(zhuǎn)Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中GSK3β 活性的增加。由于已經(jīng)表明GSK3β是PI3K/AKT的關(guān)鍵下游底物，因此我們可以得出結(jié)論，Dex 通過PI3K/AKT/GSK3β 信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，并且ROS在其中起重要的調(diào)控作用。

本研究還具有一些不足之處，例如缺少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的活體內(nèi)研究，以及并未做信號(hào)通路的阻斷實(shí)驗(yàn)等等，這些將是下一步研究要解決的問題。

總之，本研究表明Dex 可通過ROS-PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，并建議ROS 可能是Dex 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡的治療或預(yù)防靶標(biāo)。另外，仍需進(jìn)一步的體內(nèi)研究以驗(yàn)證本研究中的發(fā)現(xiàn)。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。