田金鳳，尚遠(yuǎn)宏*

（攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院，四川攀枝花 617000）

四川省攀枝花市位于亞熱帶地區(qū)，且具有以南亞熱帶為基帶的島狀式立體氣候和充足的光熱，盛產(chǎn)熱帶和亞熱帶水果。石榴、芒果、火龍果作為攀枝花主要熱作水果，隨著種植面積逐年擴(kuò)大，病害程度隨之增加[1-3]，而生產(chǎn)過程中殺菌劑施用不合理，造成3種水果農(nóng)藥殘留問題日益凸顯，導(dǎo)致其安全性受到影響，因而高效檢測石榴、芒果、火龍果中的殺菌劑殘留變得非常重要。

三唑類殺菌劑為全球殺菌劑類別中品種最多的一個大類[4]，具有高效、內(nèi)吸、廣譜等特點，可防治果樹及其他作物的多種銹病、白粉病、葉斑病、根腐病、炭疽病等病害[5]。在GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中，石榴、芒果和火龍果屬于皮不可食的熱帶和亞熱帶水果，且對于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食品中農(nóng)藥最大殘留限量，芒果有3種專屬（直接檢測）的三唑類殺菌劑（戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑）、石榴有2種專屬的三唑類殺菌劑（苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑）、火龍果無檢測的殺菌劑[6]。同時，現(xiàn)執(zhí)行的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》前處理操作繁瑣，成本高，費時費力，不適合大批量樣品的快速定性及定量分析[7]；且尚未見同時檢測三唑酮、戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑等5種三唑類殺菌劑的殘留報道。因此，探討并建立檢測皮不可食的熱帶和亞熱帶水果（以石榴、芒果和火龍果為研究對象）中5種低毒內(nèi)吸性三唑類殺菌劑殘留標(biāo)準(zhǔn)具有實際意義。

高通量檢測蔬菜及水果中農(nóng)藥殘留的最有效和快速的前處理凈化方法是QuEChERS法[8]，而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）是農(nóng)藥殘留分析的熱點技術(shù)之一[9-10]，但二者結(jié)合分析時，由于樣品提取溶劑及量的變化，可能會造成環(huán)境污染和溶劑效應(yīng)，因此本實驗對QuEChERS填料和提取溶劑、體積、提取次數(shù)等進(jìn)行篩選，采用UPLC-MS/MS法測定3種水果中5種殺菌劑殘留，以期為國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于皮不可食的熱帶和亞熱帶水果的農(nóng)藥最大殘留限量檢測指標(biāo)增加和方法建立的制定提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

芒果、石榴、火龍果：攀枝花地區(qū)采摘。

1.1.2 化學(xué)試劑

甲醇（色譜級）：美國Fisher公司；農(nóng)藥（三唑酮、戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑）標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6460A超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀：美國Agilent公司；1-14k離心機(jī)：美國Sigma公司；FA2014B電子天平：上海越平公司；Milli-Q IQ7000超純水器：美國Millipore公司；Vortex 4渦旋混合器：比利時LMS公司；NEVAP-45氮吹儀：美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

4 mmol/L甲酸的水溶液：準(zhǔn)確吸取0.15 mL甲酸，用水稀釋并定容至1 L。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取適量5種三唑類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃避光保存。其他濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇定量稀釋即得。

1.3.2 樣品前處理

芒果去皮去核取可食用部分、石榴去皮取可食用部分、火龍果去葉冠取可食用部分，分別稱取10.0 g石榴、芒果、火龍果樣品（精確至0.01 g），分別置于50 mL聚丙烯刻度離心管中，加入10 mL0.5%甲酸乙腈溶液[11]，振蕩渦旋20 min，加入氯化鈉1 g和無水硫酸鎂5 g[12-14]，立即渦旋混勻10 s，然后10 000 r/min離心5 min，取上清液5.0 mL，加入QuEChERS試劑管中渦旋混勻1 min，10 000 r/min離心3 min，取上清液0.5 mL，用水定容至1 mL，混勻后14 000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜，即得。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：4 mmol/L甲酸的水溶液-甲醇[15-16]，梯度洗脫；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL；柱溫：30 ℃；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序：0～7.5 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)由30%升至90%；7.5～10 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為90%；10～10.5 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)由90%降至30%；10.5～15 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為30%。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（multiple-reaction monitoring，MRM）；霧化氣壓力45 psi；輔助氣（auxiliary gas flow，AUX）流速11 L/min；輔助氣溫度300 ℃；電噴霧電壓4 000 V[17]。

5種三唑類殺菌劑的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式下5種三唑類殺菌劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 5 kinds of triazole fungicides under multiple reaction monitoring mode

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限的測定

配制好的5種三唑類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋成400 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用空白石榴、芒果、火龍果基質(zhì)提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成200 μg/L、100 μg/L、80 μg/L、40 μg/L、20 μg/L、10 μg/L、4 μg/L系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，采用外標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比（S/N≥3）和10倍信噪比（S/N≥10）分別確定檢出限（limit of detection，LOD）與定量限（limit of quantitation，LOQ）[18-20]。

1.3.5 加標(biāo)回收率和精密度測定

空白的芒果、石榴、火龍果各樣品分別添加標(biāo)準(zhǔn)液（5 μg/kg、20 μg/kg、100 μg/kg）3個水平下，搖勻、靜置后按1.3.2方法處理，進(jìn)行空白加標(biāo)回收率試驗。同時，每個水平重復(fù)6次，測定平均回收率和精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實驗的平均值，采用Microsoft Excel 2010軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，通過Origin7.5軟件進(jìn)行制圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

5種三唑類殺菌劑的MRM色譜圖見圖1，二級離子質(zhì)譜圖見圖2。

圖1 100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of 100 μg/L mixed standard solution

圖2 5種殺菌劑的二級離子質(zhì)譜圖Fig.2 Secondary ion mass spectrometry of 5 kinds of triazole fungicides

由圖1可知，三唑酮、腈菌唑、戊唑醇、丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑經(jīng)色譜分離流出的組分不斷進(jìn)入質(zhì)譜，質(zhì)譜連續(xù)掃描進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，每一次掃描得到一張質(zhì)譜圖，將每一張質(zhì)譜圖中所有離子強度相加，得到一個混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總的離子流強度。由圖2可知，定量離子色譜圖反映了（目標(biāo)化合物的特征離子）色譜峰的定性，峰的一致性測定。

2.2 方法的線性關(guān)系及檢出限

5種三唑類殺菌劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2、線性范圍及檢出限見表2。由表2可知，5種三唑類殺菌劑在4.0～200.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999，檢出限（LOD）為0.05～0.3 μg/kg，定量限（LOQ）為0.15～1.0 μg/kg，低于國家規(guī)定的最大殘留限量值[12]。

表2 5種殺菌劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限、定量限Table 2 Linear regression equation,range,correlation coefficient,limit of detection and limit of quantitation of 5 kinds of fungicides

2.3 方法的回收率與精密度

表3 5種殺菌劑的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Standard recovery rates and relative standard deviations of 5 kinds of fungicides (n=6)

續(xù)表

由表3可知，分別以5 μg/kg、20 μg/kg、100 μg/kg的水平將5種三唑類殺菌劑添加到空白芒果基質(zhì)中，測定回收率，5種三唑類殺菌劑在凱特芒果中的回收率范圍為87.7%～103.1%，RSD為4.1%～11.2%；以5 μg/kg、20 μg/kg、80 μg/kg的水平將5種三唑類殺菌劑添加到空白石榴基質(zhì)、火龍果基質(zhì)中，測定回收率，5種三唑類殺菌劑的回收率范圍分別為80.5%～93.5%，81.6%～94.7%；RSD分別為3.8%～7.3%，4.3%～10.2%；結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度和精密度滿足農(nóng)藥定量分析要求[21]。

2.4 實際樣品分析

按選定的試驗方法下，對攀枝花地區(qū)的各20份突尼斯軟籽石榴、凱特芒果、紅心火龍果進(jìn)行分析，三唑酮等5種三唑類殺菌劑的殘留量均低于檢測限，均未檢出。

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法中含5種農(nóng)藥殘留以適用于“其他食品”或“其他蔬菜和水果”可參照執(zhí)行的檢測方法相比，GB 23200.8—2016中規(guī)定LOQ的三唑酮（0.025 0 mg/kg）、腈菌唑（0.012 6 mg/kg）、丙環(huán)唑（0.037 6 mg/kg）和戊唑醇（0.037 6 mg/kg）[22]；GB 23200.49—2016中苯醚甲環(huán)唑的LOQ為0.005 mg/kg[23]；均比本研究中5種相應(yīng)三唑類殺菌劑的殘留LOQ規(guī)定值大，而定量限是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，本方法從定量限方面體現(xiàn)了分析方法具備了更靈敏的定量檢測能力，能滿足3種水果中5種三唑類殺菌劑殘留檢測的要求。

3 結(jié)論

本實驗結(jié)合固相萃取技術(shù)，以高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法建立了攀枝花本地的突尼斯軟籽石榴、凱特芒果、紅心火龍果中5種低毒內(nèi)吸性三唑類殺菌劑殘留的分析測定方法。該方法前處理操作簡單，凈化效果好，靈敏度高，干擾少，其LOQ可達(dá)到0.15 μg/kg，在實際檢測中具有較強的可行性和實用性，也適用于各水果中5種農(nóng)藥殘留的定性和定量分析，且對于未來“食品中農(nóng)藥最大殘留限量”標(biāo)準(zhǔn)的完善3種熱作水果中多種三唑類殺菌劑殘留的檢測方法和限量標(biāo)準(zhǔn)的制定是十分必要的。