陳華偉，樂小鳳，張振文，2*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100）

氨基酸是葡萄中重要的含氮化合物，主要分布在果皮和果肉中，在釀酒過程中為釀酒酵母提供動(dòng)力，也是葡萄中某些香氣的前體物質(zhì)[1]。氨基酸對(duì)葡萄酒風(fēng)味的影響主要集中在它們的次級(jí)產(chǎn)物支鏈和芳香族氨基酸的代謝上，如高級(jí)醇及其相關(guān)的酯、氧化醛等[2]。研究證明揮發(fā)性酚類、醚類和酯類物質(zhì)是由色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸作為前體物質(zhì)通過莽草酸途徑合成。亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸可能是甲氧基吡嗪的合成底物，在葡萄果實(shí)中是青椒味香氣特征的重要化合物，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味具有一定影響[3]。氨基酸濃度和組成會(huì)受葡萄品種、成熟度、砧木和氣候等條件影響[4-5]。ITAY M等[6]研究發(fā)現(xiàn)，通過添加外源亮氨酸和苯丙氨酸可以促進(jìn)玫瑰香葡萄中醛類和醇類的合成。顏孫安等[7]的研究表明，精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等風(fēng)味氨基酸，隨采摘期延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。

陜西涇陽屬大陸性季風(fēng)氣候，降水主要集中在葡萄生長(zhǎng)和成熟時(shí)期，易導(dǎo)致葡萄果實(shí)發(fā)生病害和品質(zhì)降低[8]。避雨栽培在樹冠頂部設(shè)置薄膜等設(shè)施，不用裙邊，保持四周通風(fēng)，以達(dá)到避免雨水侵襲葡萄果實(shí)的目的。研究表明，避雨栽培可降低空氣濕度、有效減輕葡萄病害和農(nóng)藥殘留、提高果實(shí)品質(zhì)、擴(kuò)大栽培范圍，提高生產(chǎn)效益[9-10]，但是避雨栽培條件下光照減弱[11]，給果樹生長(zhǎng)和品質(zhì)帶來不利。劉玉蘭等[12]研究表明，弱光條件下，使用彩色薄膜可以通過調(diào)節(jié)光質(zhì)進(jìn)而促進(jìn)葡萄的光合作用。不同顏色薄膜有不同的熱量和輻射特性，紫色棚膜能促進(jìn)葡萄果實(shí)還原糖、單寧和總花色苷的積累，藍(lán)色棚膜則有利于類黃酮類物質(zhì)的積累[13]。HEO J等[14]研究表明，混合光可通過提高凈光合速率進(jìn)而促進(jìn)植株生長(zhǎng)。KURILCIK A等[15]研究證實(shí)，藍(lán)光有利于光合色素的形成。粉紅色熒光薄膜可以改變?cè)O(shè)施內(nèi)的光質(zhì)，從而改善陽光玫瑰葡萄的品質(zhì)[16]。但不同顏色棚膜對(duì)釀酒葡萄成熟時(shí)氨基酸含量的影響研究較少。

主成分分析（principal components analysis，PCA）是將原始變量重新組成新的互相無關(guān)的幾個(gè)綜合變量，進(jìn)而代替原始變量的統(tǒng)計(jì)方法[17]。由于果實(shí)中氨基酸與葡萄酒香氣的密切關(guān)系，本試驗(yàn)通過選用不同顏色薄膜改變光質(zhì)，研究薄膜顏色對(duì)赤霞珠（Cabernet Sauvignon）氨基酸含量的影響，采用主成分分析和相關(guān)分析對(duì)氨基酸成分進(jìn)行差異性分析，以期了解這些氨基酸組分的變化規(guī)律，旨在篩選最佳棚膜顏色，為提升中國(guó)夏季多雨地區(qū)釀酒葡萄原料的品質(zhì)提供理論參考。本試驗(yàn)通過選用不同顏色薄膜改變光質(zhì)，主要研究薄膜顏色對(duì)赤霞珠氨基酸含量的影響，旨在篩選最佳棚膜顏色，為提升中國(guó)夏季多雨地區(qū)釀酒葡萄原料的品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

赤霞珠葡萄：陜西涇陽日新農(nóng)業(yè)葡萄生產(chǎn)基地，定植于2009年，行距為0.8 m×2.5 m，進(jìn)行常規(guī)田間栽培管理。

1.1.2 化學(xué)試劑

鹽酸、甲酸、碳酸鈉、甲基纖維素、硫酸銨、十二水合磷酸氫二鈉、甲醇和乙腈（均為分析純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（The）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro））（純度＞99%）、磷酸鹽緩沖液、鄰苯二甲醛（phthalic dicarboxaldehyde，OPA）、9-芴甲基氯甲酸酯（9-fluorene methyl chloroformate，F(xiàn)MOC）：日本Shimadzu公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030型島津高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配二極管陣列（photo-diode array，PDA）檢測(cè)器）、AJS-02色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）：日本島津公司；GL-20G-H型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在陜西省涇陽縣日新農(nóng)業(yè)葡萄生產(chǎn)基地進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。2016年和2017年在赤霞珠葡萄轉(zhuǎn)色前一周搭建白色、藍(lán)色和紫色的無滴聚乙烯膜（厚度為0.06 mm，棚寬1.7 m，高2.2 m），不處理的葡萄為對(duì)照。每個(gè)處理90棵葡萄樹，重復(fù)3次。采樣時(shí)兼顧陰面和陽面，從每穗葡萄肩、中、頂部采取長(zhǎng)勢(shì)一致的葡萄果實(shí)。各重復(fù)隨機(jī)選取30株，每株隨機(jī)選取1穗，每穗采5粒，編號(hào)記錄，于-40 ℃貯藏待用。

1.3.2 果實(shí)氨基酸含量的測(cè)定

氨基酸含量的測(cè)定主要參考YUE X F等[18]的方法，每個(gè)處理隨機(jī)取100粒果實(shí)，在液氮環(huán)境下去籽后磨粉，將粉末收集于50 mL離心管中，4 ℃條件下浸漬4 h后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，用0.45 μm的尼龍膜過濾葡萄汁，取100 μL過濾后的葡萄汁與50 μL內(nèi)標(biāo)和400 μL 0.1mol/LHCl混合，分離柱為AJS-02色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm），柱溫：45 ℃。洗脫液A：2 000 mL鹽酸緩沖液（pH 8.2），9.0 g磷酸氫二鈉十二水合物和9.5 g四硼酸鈉十水合物；洗脫液B：水∶乙腈∶甲醇（10∶45∶45，V/V）。氨基酸的定性和定量參照劉沛通等[19]方法，每樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值（n=3）。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Duncan's差異顯著性分析，顯著水平P＜0.05。用Origin 2018軟件制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同棚膜顏色對(duì)果實(shí)氨基酸含量的影響

2016年和2017年不同棚膜避雨栽培模式下的氨基酸含量分別見表1和表2。

表1 2016年棚膜顏色對(duì)葡萄氨基酸含量的影響Table 1 Effect of color of rain-shelter plastic film on amino acids contents of grape in 2016

從表1和表2可看出，4種栽培模式下均檢測(cè)到15種氨基酸組分，精氨酸含量（173.31～457.19 mg/L）均是最高的，其次是酪氨酸（180.63～185.32 mg/L）、脯氨酸（162.57～195.08 mg/L）、賴氨酸（145.48～152.11 mg/L）和胱氨酸（117.68～125.43 mg/L），天冬氨酸（10.64～42.06 mg/L）、甲硫氨酸（24.75～25.46 mg/L）、甘氨酸（26.61～32.49 mg/L）和異亮氨酸（21.99～28.66 mg/L）含量均較少。

表2 2017年棚膜顏色對(duì)葡萄氨基酸含量的影響Table 2 Effect of color of rain-shelter plastic film on amino acids contents of grape in 2017

兩年間赤霞珠葡萄果實(shí)的酪氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸含量相對(duì)穩(wěn)定，且不同處理間無顯著差異（P＞0.05）。天冬氨酸和谷氨酸在發(fā)酵時(shí)可優(yōu)先被釀酒酵母所利用，從表1可看出，藍(lán)色和白色棚膜可以顯著提高赤霞珠葡萄中的天冬氨酸谷氨酸含量（P＜0.05），紫色棚膜栽培模式和露天栽培模式下天冬氨酸含量差異不顯著（P＞0.05），谷氨酸含量略低。從表2可看出，天冬氨酸、谷氨酸和絲氨酸含量均為露天栽培模式下最低，搭建白色、藍(lán)色和紫色棚膜均顯著提高了這三種氨基酸的含量（P＜0.05）。

纈氨酸和異亮氨酸在葡萄酒釀造過程中可相應(yīng)地轉(zhuǎn)化為異丁醇、丙醇、異戊醇和活性戊醇，這些高級(jí)醇也可進(jìn)一步形成高級(jí)醇醋酸酯，這些酯類和醇類物質(zhì)是酒中主要的發(fā)酵香成分。由表1可知，纈氨酸含量在露天栽培模式下最低，紫色、藍(lán)色和白色棚膜模式下其含量分別提高了66.24%、59.29%和38.92%；異亮氨酸也表現(xiàn)為露天栽培模式下含量較低。氨基酸濃度影響葡萄酒的香氣品質(zhì)，蘇氨酸含量越高，酒中苯乙醇和異戊醇含量較高[20]。由表1看出，藍(lán)色棚膜顯著提高了蘇氨酸含量（P＜0.05），相比于露天栽培下的葡萄，其含量提高了21.45%。結(jié)合表2可看出，不同顏色棚膜對(duì)蘇氨酸和異亮氨酸的影響受年份變化較小，纈氨酸則年份差異較大，2017年表現(xiàn)出不同處理間含量差異不顯著（P＞0.05）。

精氨酸是葡萄中氮的主要儲(chǔ)存形式，前人研究表明，精氨酸在赤霞珠葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)色期時(shí)大量積累，在成熟前有小幅度的降低[21]。由表1和表2可知，精氨酸含量?jī)赡瓴町愝^大，2016年含量變化范圍為173.31～333.37 mg/L，2017年則為283.32～457.19 mg/L。2016年，相比于露天栽培模式，藍(lán)色棚膜顯著提高了葡萄中精氨酸的含量，紫色和白色棚膜則使精氨酸含量顯著降低（P＜0.05）；2017年，三種顏色棚膜均顯著提高了葡萄中氨基酸含量，藍(lán)色、白色和紫色棚膜分別顯著提高了61.36%、48.87%和27.97%（P＜0.05）。不同栽培模式下，組氨酸含量差異不大。就甘氨酸和丙氨酸含量來看，2016年藍(lán)色棚膜相比于露天栽培模式下分別提高了21.19%和25.62%；2017年藍(lán)色和白色棚膜均顯著提高了丙氨酸的含量（P＜0.05）。脯氨酸是一種植物相容滲透劑，有利于抵御滲透脅迫[22-24]。2016年，藍(lán)色棚膜顯著提高了葡萄中脯氨酸含量（P＜0.05），紫色和白色棚膜栽培模式下葡萄的脯氨酸含量則略有降低；2017年，三種顏色棚膜均使其含量增加，白色棚膜顯著提升了18.15%。就氨基酸總量來看，2016年，相比于露天栽培模式下的葡萄（1 351.82 mg/L），藍(lán)色棚膜（1 560.33 mg/L）顯著提高了葡萄中氨基酸的總量（P＜0.05），白色棚膜（1 359.28 mg/L）下的葡萄氨基酸總量差異不顯著，紫色棚膜則使其含量略有降低；2017年，三種顏色棚膜均顯著提高了葡萄中的氨基酸總量（P＜0.05），露天栽培模式下氨基酸總量為1 371.76 mg/L，紫色、藍(lán)色和白色棚膜栽培模式下葡萄的氨基酸總量分別是1 527.01 mg/L、1 640.76 mg/L和1 615.62 mg/L，連續(xù)兩年藍(lán)色棚膜均可顯著提高葡萄的氨基酸總量（P＜0.05）。

2.2 不同棚膜顏色下果實(shí)精氨酸和脯氨酸含量比值分析及氨基酸含量相關(guān)性分析

棚膜顏色對(duì)精氨酸與脯氨酸含量比值的影響情況見圖1。

圖1 2016年（A）和2017年（B）棚膜顏色對(duì)精氨酸與脯氨酸比值的影響Fig.1 Effect of color of rain-shelter plastic film on the ratio of arginine to proline in 2016 (A) and 2017 (B)

精氨酸通常是葡萄果實(shí)中含量最高的氨基酸，脯氨酸含量也比較高但不能被釀酒酵母同化吸收，所以精氨酸與脯氨酸含量的比例通常用來衡量葡萄的可同化氮狀況，比值越高則酵母可利用氮源比例越高[25]。由圖1可知，2016年，藍(lán)色棚膜顯著提高了精氨酸與脯氨酸的比值（P＜0.05），紫色棚膜則顯著降低了其比值（P＜0.05）；2017年，三種顏色的棚膜均顯著提高了精氨酸與脯氨酸的比值（P＜0.05），可看出該比值受棚膜顏色影響與氨基酸總量一致。

圖2 2016年（A）和2017年（B）不同處理的赤霞珠葡萄氨基酸含量的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of the contents of amino acids in Cabernet Sauvignon with different treatments in 2016 (A) and 2017 (B)

由圖2可知，2016年時(shí)，天冬氨酸與谷氨酸呈顯著正相關(guān)，組氨酸與甲硫氨酸、酪氨酸、賴氨酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），甲硫氨酸與酪氨酸、賴氨酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），酪氨酸與賴氨酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），精氨酸與異殼氨酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），天冬氨酸與甲硫氨酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；2017年，精氨酸與谷氨酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），脯氨酸與天冬氨酸、谷氨酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），甲硫氨酸與蘇氨酸、賴氨酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），蘇氨酸與賴氨酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），丙氨酸與谷氨酸、纈氨酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），精氨酸與甲硫氨酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

2.3 不同棚膜顏色下果實(shí)氨基酸含量主成分分析

用SPSS 19.0對(duì)赤霞珠的15種氨基酸及其總量進(jìn)行主成分分析，結(jié)果分別見圖3和圖4。

由圖3可知，2016年，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為97.1%，第1主成分（principal component，PC）方差貢獻(xiàn)率為84.1%，第2主成分方差貢獻(xiàn)率為13%。不同處理的分布比較分散，紫色棚膜處理下的葡萄在第一主成分的正方向，受纈氨酸含量影響較大；藍(lán)色棚膜處理下的葡萄在第一主成分的負(fù)方向，主要受葡萄中精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸含量的影響；白色棚膜處理下的葡萄在第二主成分的正方向，脯氨酸、組氨酸和甘氨酸含量的影響力較高；露天栽培模式下的葡萄主要分布在第二主成分的正方向。

圖3 2016年不同處理的赤霞珠葡萄氨基酸含量的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of the contents of amino acids in Cabernet Sauvignon with different treatments in 2016

由圖4可知，2017年，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為97.6%，第1主成分方差貢獻(xiàn)率為94.6%，第2主成分方差貢獻(xiàn)率為3%。不同處理的分布與2016年差異較大，露天栽培模式下的葡萄主要分布在第一主成分的正方向；藍(lán)色和白色棚膜處理下的葡萄在第一主成分的負(fù)方向，受精氨酸含量影響較大；紫色棚膜處理下的葡萄主要受纈氨酸和谷氨酸等的影響。

圖4 2017年不同處理的赤霞珠葡萄氨基酸含量的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of the contents of amino acids in Cabernet Sauvignon with different treatments in 2017

3 討論

游離氨基酸是果實(shí)中的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)的合成前體，在香蕉[27]、草莓[28]、蘋果[29]、番茄[30]和甜瓜[31]等果實(shí)上均表明相關(guān)氨基酸作為重要前體參與了支鏈酯類的合成。一些氨基酸先通過轉(zhuǎn)氨作用形成支鏈酮酸，然后經(jīng)脫氫或脫羧形成?；o酶A和支鏈醇，再經(jīng)過醇脫氫酶和醇?；D(zhuǎn)移酶的催化進(jìn)而形成支鏈酯類物質(zhì)[30]。氨基酸濃度和組成受到氣候等條件影響。本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)結(jié)果表明，相比于露天栽培，避雨栽培能夠降低60%左右的風(fēng)速，不同顏色棚膜的避雨栽培均能降低葡萄果穗水平的空氣溫度，同時(shí)升高其濕度，造成溫濕度差異的主要原因可能是不同顏色棚膜透過的光強(qiáng)、光質(zhì)不同[31-33]。劉玉蘭等[12]研究結(jié)果表明彩色薄膜對(duì)葡萄光合作用有促進(jìn)作用，紅光和藍(lán)光處理可以改善‘巨峰’葡萄果實(shí)品質(zhì)[34]。本試驗(yàn)通過研究不同顏色棚膜對(duì)赤霞珠葡萄氨基酸含量的分析發(fā)現(xiàn)，連續(xù)兩年，藍(lán)色棚膜可以顯著提升葡萄中氨基酸含量。本課題組實(shí)驗(yàn)監(jiān)控發(fā)現(xiàn)，2017年生長(zhǎng)季的降雨量要比2016年大，三種顏色棚膜均使氨基酸含量提升，其中藍(lán)色棚膜栽培模式下，赤霞珠葡萄的氨基酸含量最高，紫色棚膜受年份影響在兩年表現(xiàn)不一致，這可能與不同顏色棚膜在不同年份下果穗光照、溫度條件不同有關(guān)，但兩年同時(shí)提高了異亮氨酸的含量。張克坤等[35]研究結(jié)果表明，藍(lán)光可以促進(jìn)果實(shí)成熟和改善果實(shí)品質(zhì)，其推測(cè)可能是由于藍(lán)光條件下果實(shí)內(nèi)糖代謝底物充足。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以赤霞珠葡萄為試材，研究不同顏色避雨棚膜對(duì)氨基酸含量的影響，研究結(jié)果表明，連續(xù)兩年，藍(lán)色和白色棚膜顯著提高了葡萄中的谷氨酸、絲氨酸和天冬氨酸含量，紫色棚膜受年份影響在兩年表現(xiàn)不一致，但兩年同時(shí)提高了異亮氨酸的含量；藍(lán)色棚膜顯著提高了葡萄中精氨酸、甘氨酸和丙氨酸等大部分氨基酸的含量。綜合考慮，藍(lán)色棚膜是提升赤霞珠葡萄氨基酸含量的最佳棚膜。