邢曉瑩，劉 毅，霍乃蕊，武曉英*

（1.太原師范學(xué)院生物系，山西太原 030619；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院（山西省農(nóng)科院園藝研究所），山西晉中 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西晉中 030801）

棗（Ziziphus jujubaMill.）為鼠李科棗屬植物[1]，落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)于中國(guó)，已有3 000多年的栽培歷史[2]。木棗為棗的一個(gè)品種，主要分布于陜晉黃河沿岸的夾谷地帶[3]。其中，呂梁地區(qū)是我省木棗的主要栽培區(qū)，種植面積約13.33×104hm2，占全省紅棗種植面積的40%；年產(chǎn)量約3×108kg，約占全省紅棗產(chǎn)量的60%[4]。棗果實(shí)不僅味道甘甜、營(yíng)養(yǎng)豐富，同時(shí)也是補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血安神的常用中藥，其果實(shí)中除了含有較多的礦元素和多種維生素外，還含有豐富的氨基酸、黃酮類化合物、酚類化合物、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、多糖類（水溶性的中性多糖、酸性多糖）等功能性物質(zhì)，具有清除自由基、延緩衰老的功效，提高機(jī)體細(xì)胞的免疫活性和抗補(bǔ)體等生理活性。

果酒是以新鮮水果（葡萄、蘋果、梨、山楂、柿子等）或果品加工下腳料為主要原料，利用微生物發(fā)酵技術(shù)釀制的一種營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酒精飲料，酒精度通常在15%vol以下[5]。果酒不僅保留了各類水果中原有的營(yíng)養(yǎng)成分，在發(fā)酵過(guò)程中還能生成多種新的功能性成分（如阿洛糖、阿洛酮糖等）[6-10]，兼具營(yíng)養(yǎng)和保健功能。與白酒和啤酒相比，果酒的果香濃郁、色澤鮮艷，消費(fèi)市場(chǎng)前景廣闊。呂梁的木棗在豐收之年，常會(huì)面臨著產(chǎn)品滯銷、銷售價(jià)格低、入不敷出等問(wèn)題，大量的木棗甚至無(wú)人采摘而爛在了地里，嚴(yán)重影響了棗農(nóng)種植、管理木棗的積極性。木棗鮮果中的含糖量在40%以上，干果中的含糖量達(dá)85%左右[11]，如能將其釀制成果酒或果醋，不僅能充分利用木棗資源，解決果品產(chǎn)能過(guò)剩、損傷及殘次果滯銷等問(wèn)題，還能提高水果附加值及利用率，增加農(nóng)民收入，輻射周邊經(jīng)濟(jì)發(fā)展及提高企業(yè)收入，均具有重要意義。

山西老陳醋是我國(guó)傳統(tǒng)的谷物釀造醋，其發(fā)酵過(guò)程中含有豐富的微生物資源，主要釀造微生物除醋酸菌外，還有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌等。參與發(fā)酵的釀造微生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的高溫、高酒精度和高酸馴化，分離得到功能菌種，具有耐受性好、致病率低等特點(diǎn)?；诖?，本研究采用風(fēng)味導(dǎo)向的方法，從山西老陳醋酒醪中篩選產(chǎn)酯能力強(qiáng)的功能酵母菌，結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及26S rDNA基因序列分析技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。通過(guò)研究目標(biāo)菌株的生物學(xué)特性（環(huán)境耐受性）及其在棗果酒發(fā)酵過(guò)程中的實(shí)際產(chǎn)酯效果，探究該菌株的商業(yè)價(jià)值，為棗酒的純種發(fā)酵或強(qiáng)化發(fā)酵提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料及菌株

酒醪（發(fā)酵3 d、5 d、15 d的酒醪）：山西老陳醋集團(tuán)有限公司；安琪生香活性干酵母（多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha））Y24、安琪果酒專用酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；木棗：產(chǎn)自呂梁地區(qū)。

1.1.2 培養(yǎng)基

孟加拉紅篩選培養(yǎng)基[12]：蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，瓊脂1.5%，孟加拉紅0.003 3%，氯霉素0.01%，pH自然，121 ℃滅菌15 min。

產(chǎn)酯發(fā)酵液[13]：葡萄糖8%，酵母膏1%，蛋白胨2%，pH 4.5±0.2，121 ℃滅菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基[13]：蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母浸粉1%，pH 6.5±0.2，121 ℃滅菌15 min。固體培養(yǎng)基中添加1.5%的瓊脂粉。

麥芽汁液體培養(yǎng)基[14]：氯霉素0.01%，麥芽膏粉13%，pH 6.0±0.2，121 ℃滅菌15 min。固體培養(yǎng)基中添加1.5%的瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑

酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；孟加拉紅培養(yǎng)基、氫氧化鈉、無(wú)水葡萄糖、濃鹽酸、氯化鈉、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂、無(wú)水乙醇、偏重亞硫酸鉀、抗壞血酸：北京索萊寶科技有限公司；LALLZYME HC果膠酶（20 000 U/g）：法國(guó)LAFFORT公司；所用試劑均為生化試劑或分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-1ND型無(wú)菌超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾濱儀器設(shè)備有限公司；LS-35LJ型立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；ZQPL-200型立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱：天津萊玻特瑞設(shè)備有限公司；DyNA-Quant-200型熒光計(jì)：通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部；UVP凝膠成像系統(tǒng)：上海書俊儀器設(shè)備有限公司；5424R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；7500聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)ABI公司；CX41型生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌的分離

參照文獻(xiàn)[15]采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法進(jìn)行分離。

1.3.2 產(chǎn)酯酵母菌的篩選

將保存在斜面上的菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28℃、130 r/min條件下活化培養(yǎng)24 h。按2%接種量將活化后的菌株（107CFU/mL）接種于產(chǎn)酯發(fā)酵液中，28 ℃靜置培養(yǎng)7 d，按國(guó)標(biāo)GB 19777—2005《原產(chǎn)地域產(chǎn)品山西老陳醋》附錄C中的方法測(cè)定發(fā)酵液中的總酯含量[16]，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 產(chǎn)酯酵母菌的鑒定

形態(tài)觀察：將篩選菌株劃線接種于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察單菌落特征，記錄菌落的形狀大小、菌落顏色、表面情況（粗糙或光滑、有無(wú)光澤）、隆起程度、邊緣情況等[14]。將篩選菌株接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀測(cè)其細(xì)胞形態(tài)（大小、形狀、菌絲等，×400倍）[17]。

生理生化試驗(yàn)[18-19]：對(duì)其進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、碳源同化試驗(yàn)和氮源同化試驗(yàn)。

分子生物學(xué)鑒定[20]：采用酵母基因組DNA抽提試劑盒提取篩選菌株的基因組，以其為模板，采用引物NL1和NL4對(duì)菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)合格后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）檢索，選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA D1/D2基因序列，采用MEGA 7.0生物學(xué)軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值1 000。

1.3.4 產(chǎn)酯酵母的環(huán)境耐受性分析[21-22]

以YPD液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，按2%接種量將活化后的菌液（107CFU/mL）接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值。依次考察產(chǎn)酯酵母對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（0、6%、8%、10%和12%）、培養(yǎng)溫度（30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃、42 ℃、45 ℃）、pH（4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0）、糖度（10°Bx、15°Bx、20°Bx、25°Bx、30°Bx、35°Bx）及SO2添加量（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L）的耐受能力。

1.3.5 木棗果酒釀造工藝

操作要點(diǎn)：稱取無(wú)病蟲害的、去核后的木棗5 kg，加入木棗質(zhì)量3倍的水以及0.01%的偏重亞硫酸鉀和0.1%的抗壞血酸組成的復(fù)合護(hù)色液打漿，80 ℃熱處理10 min。冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入20 L的發(fā)酵罐中，加入果膠酶，酶制劑用量為果漿質(zhì)量的0.01%，攪拌均勻，在25～30 ℃的條件下靜置8～10 h。將蔗糖熔化成的糖漿煮沸殺菌后加入果漿中，調(diào)整初始糖度為15°Bx。先接種產(chǎn)酯酵母有氧發(fā)酵24 h，再接種安琪果酒專用酵母有氧發(fā)酵24 h，之后封口發(fā)酵7 d。發(fā)酵結(jié)束的果酒上清液經(jīng)0.22 μm的濾芯除菌過(guò)濾，在60～70 ℃條件下加熱15～20 min進(jìn)行巴氏殺菌，最后靜置陳釀一段時(shí)間，經(jīng)檢驗(yàn)合格進(jìn)行無(wú)菌灌裝，得到木棗果酒樣品。

1.3.6 木棗果酒釀造工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

以總酯含量作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，固定基本條件為料液比1∶3（g∶mL），初始發(fā)酵糖度調(diào)整至15°Bx，順序接種6%的產(chǎn)酯酵母和0.5%安琪果酒專用酵母，28 ℃酒精發(fā)酵7 d。每天取樣檢測(cè)發(fā)酵液的糖度、酒精含量和總酯含量。在此基礎(chǔ)上，采用單因素輪換法，分別考察并確定出料液比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g∶mL））、發(fā)酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、產(chǎn)酯酵母接種量（2%、4%、6%、8%、10%）和發(fā)酵時(shí)間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）這4個(gè)因素的最佳水平。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比（A）、產(chǎn)酯酵母接種量（B）和發(fā)酵溫度（C）3個(gè)影響較大的因素為自變量，以發(fā)酵結(jié)束時(shí)的酒精度（Y1）和總酯含量（Y2）為響應(yīng)值，利用軟件Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 木棗果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of jujube fruit wine

1.3.7 酒精度的測(cè)定

采用蒸餾法[22]測(cè)定酒精度。

1.3.8 風(fēng)味及口感的測(cè)定

選10名食品專業(yè)人員參照國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[23]，分別對(duì)木棗果酒產(chǎn)品的風(fēng)味及口感進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用MEGA 7.0生物學(xué)軟件和Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離

從孟加拉紅篩選培養(yǎng)基上挑取具有明顯酵母菌形態(tài)特征的菌落，經(jīng)純化后初步篩選出23株酵母，編號(hào)為Y1～Y23。

2.2 產(chǎn)酯酵母菌的篩選

以安琪生香活性干酵母Y24為對(duì)照，測(cè)定23株產(chǎn)酯酵母菌株的產(chǎn)酯能力，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，與對(duì)照菌株Y24相比，菌株Y2、Y5、Y8、Y14和Y18產(chǎn)酯能力較強(qiáng)。其中，菌株Y14的產(chǎn)酯能力最強(qiáng)，為（38.52±0.19）g/L，其次是菌株Y18[（36.04±0.28）g/L]和Y5[（35.32±0.32）g/L]。因此，選擇菌株Y14為目標(biāo)菌株。

圖1 24株酵母菌株的總酯產(chǎn)量Fig.1 Total ester production of 24 yeast strains

2.3 產(chǎn)酯酵母菌株Y14的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察結(jié)果

菌株Y14的菌落及細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株Y14在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，菌落呈圓形，淺白灰色，表面平滑，不反光，邊緣整齊。在麥芽汁液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)3 d，細(xì)胞大小為（4.6～6.5）×（3.8～6.5）μm，呈卵形、球形，不產(chǎn)生假菌絲。

圖2 菌株Y14的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.2 Colony (a) and cell (b) microphotographs of strain Y14

2.3.2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

菌株Y14的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，菌株Y14可以發(fā)酵或同化利用葡萄糖、D-甘露醇、琥珀酸、乳酸、甘油和KNO3，不能發(fā)酵或同化利用L-鼠李糖、可溶性淀粉、檸檬酸、肌醇、核糖醇和纖維二糖等。根據(jù)酵母菌的形態(tài)特征與生理生化特征，參照文獻(xiàn)[19，24]，初步鑒定菌株Y14為畢赤酵母屬（Pichiasp.）。

表2 菌株Y14的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical tests of strain Y14

2.3.3 26S rDNA Dl/D2序列分析結(jié)果

菌株Y14的系統(tǒng)發(fā)育樹見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株Y14與毛榛畢赤酵母（Pichia manshurica）聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定菌株Y14為毛榛畢赤酵母（Pichia manshurica）。現(xiàn)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（china general microbiological culture collection center，CGMCC），編號(hào)為2.5274。

圖3 基于26S rDNA基因序列菌株Y14的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Y14 based on 26S rDNA gene sequence

2.4 毛榛畢赤酵母Y14的環(huán)境耐受性分析

2.4.1 乙醇耐受性試驗(yàn)

乙醇是酵母菌的主要代謝產(chǎn)物，是酒精發(fā)酵階段最重要的物質(zhì)之一。發(fā)酵液中乙醇含量的積累也會(huì)對(duì)參與發(fā)酵的微生物產(chǎn)生一定的抑制和毒害作用，菌株的乙醇耐受力與乙醇產(chǎn)率密切相關(guān)，可以將其作為篩選高產(chǎn)乙醇酵母的一個(gè)參考依據(jù)[25]。菌株Y14對(duì)乙醇的耐受性見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，菌株Y14的生長(zhǎng)逐漸受到抑制。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在0～6%之間時(shí)，OD600nm值呈緩慢下降趨勢(shì)，此時(shí)的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株Y14的正常生長(zhǎng)影響較?。划?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到8%時(shí)，OD600nm值降為0.68，表明菌株Y14的生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)較緩慢；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞8%后，OD600nm值迅速降低，菌株Y14的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，基本不生長(zhǎng)。因此，確定菌株Y14的最高耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%。

圖4 菌株Y14對(duì)乙醇的耐受性Fig.4 Ethanol tolerance of strain Y14

2.4.2 pH耐受性試驗(yàn)

山西老陳醋是我國(guó)傳統(tǒng)的谷物釀造醋，是自然富集的多菌種共同發(fā)酵的過(guò)程，含有豐富的微生物資源[26]。隨著酒化時(shí)間的延長(zhǎng)，酒醪的pH值逐漸降低，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，pH值由發(fā)酵初期的3.92降至3.22，這就要求參與發(fā)酵的微生物，必須具有一定的耐酸性。菌株Y14的pH耐受性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 菌株Y14的pH耐受性Fig.5 pH tolerance of strain Y14

由圖5可知，隨著pH值的降低，菌株Y14的生物量呈先升高后降低的趨勢(shì)，適宜菌株Y14生長(zhǎng)的最佳pH值為3.5。當(dāng)pH值在3.5～4.5之間時(shí)，OD600nm值呈逐漸上升趨勢(shì)，且在pH 3.5時(shí)達(dá)到峰值（OD600nm值1.08），表明該pH值范圍適合菌體的生長(zhǎng)；當(dāng)pH值在2.5～3.5之間時(shí)，OD600nm值開始降低，表明菌株Y14的生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)較緩慢；當(dāng)pH值在2.0～2.5之間時(shí)，OD600nm值迅速降低，菌株Y14的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，基本不生長(zhǎng)。因此，確定菌株Y14的最佳培養(yǎng)pH值為3.5，可以耐受的pH值為2.5～4.5。

2.4.3 溫度耐受性試驗(yàn)

酵母菌生長(zhǎng)溫度在20～40 ℃之間，是典型的嗜溫型生物[27]。菌株Y14的溫度耐受性結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，當(dāng)溫度在28～30 ℃時(shí)，菌株Y14的OD600nm值基本保持平穩(wěn)，該溫度區(qū)間適合菌株Y14的生長(zhǎng)繁殖；當(dāng)溫度在30～39 ℃時(shí)，OD600nm值呈持續(xù)下降趨勢(shì)，表明菌株Y14的生長(zhǎng)受到了影響，菌株的繁殖能力隨溫度的升高明顯減弱；當(dāng)溫度超過(guò)42 ℃后，菌體的生長(zhǎng)繁殖基本停止，推測(cè)可能是高溫破壞酵母細(xì)胞膜，造成細(xì)胞損傷，影響細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝[28-29]。因此，確定菌株Y14的最高耐受溫度為39 ℃。

圖6 菌株Y14對(duì)溫度的耐受性Fig.6 Temperature tolerance of strain Y14

2.4.4 糖度耐受性試驗(yàn)

水果中的糖以葡萄糖、果糖、蔗糖為主，酵母菌可利用這些糖類供自身生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)進(jìn)行酒精發(fā)酵產(chǎn)生乙醇[5]。在一定范圍內(nèi)，酵母的發(fā)酵能力隨著糖濃度的增大而增強(qiáng)。但是，過(guò)高濃度的糖會(huì)對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)，高滲透壓也會(huì)造成酵母細(xì)胞的水分流失，致使其活性降低[29]。菌株Y14的糖度耐受性結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，隨著葡萄糖含量的升高，菌株Y14生物量先升高后降低，當(dāng)發(fā)酵液的糖度＜30°Bx時(shí)，不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生負(fù)影響，說(shuō)明菌株Y14對(duì)葡萄糖的耐受性較好。果酒酒精發(fā)酵時(shí)的初始糖濃度一般＜25°Bx（按葡萄糖計(jì)）[30-32]，而山西老陳醋糖化階段的還原糖含量通常＜20°Bx[12]，菌株Y14能夠發(fā)揮正常功能。因此，菌株Y14的最適發(fā)酵糖度為30°Bx，可以耐受35°Bx的糖度。

圖7 菌株Y14對(duì)糖的耐受性Fig.7 Glucose tolerance of strain Y14

2.4.5 SO2耐受性試驗(yàn)

果酒發(fā)酵前期通常需加入適量的SO2，達(dá)到防止雜菌污染、抗氧化以及護(hù)色等目的，但較高濃度的SO2對(duì)發(fā)酵主體微生物也有一定的抑制作用[33]。菌株Y14對(duì)SO2的耐受性見(jiàn)圖8。由圖8可知，菌株Y14的生長(zhǎng)隨著SO2質(zhì)量濃度的升高逐漸受到不同程度的抑制。目標(biāo)菌株在含有0～150 mg/L SO2的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)24 h后，OD600nm值略有下降，表明菌株Y14的生長(zhǎng)繁殖基本不受影響；當(dāng)SO2質(zhì)量濃度為150～250 mg/L時(shí)，OD600nm值迅速降低，表明其生長(zhǎng)受到較大程度的抑制；當(dāng)SO2質(zhì)量濃度＞250 mg/L之后，生物量基本為0，表明其生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。果酒發(fā)酵初期，為抑制或殺死其他雜菌，保證發(fā)酵的正常進(jìn)行，通常會(huì)添加60～100 mg/L的SO2[34]，菌株Y14在這個(gè)范圍內(nèi)基本不受影響，能夠正常發(fā)揮其生理功能。因此，菌株Y14最高可以耐受質(zhì)量濃度為200 mg/L的SO2。

圖8 菌株Y14對(duì)SO2的耐受性Fig.8 SO2tolerance of strain Y14

2.5 毛榛畢赤酵母Y14在木棗果酒中的應(yīng)用

2.5.1 料液比對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響

以總酯含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，料液比對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響見(jiàn)表3。由表3可知，不同的料液比對(duì)木棗果酒酒精度、總酯含量及風(fēng)味、口感的影響顯著（P＜0.05）。當(dāng)料液比為1∶2（g∶mL）時(shí)，木棗果酒的酒精度最高，達(dá)11.2%vol，總酯含量為（1.22±0.01）g/100 mL，發(fā)酵液果香濃郁，口感偏苦澀；當(dāng)料液比為1∶3（g∶mL）時(shí)，木棗果酒的酒精度為（10.6±0.16）%vol，總酯含量最高為（1.64±0.06）g/100 mL，有濃郁的棗香氣和協(xié)調(diào)的酒香，酒體豐滿，酸甜適口；當(dāng)料液比為1∶4～1∶6（g∶mL）時(shí)，棗汁濃度降低，發(fā)酵而成的木棗果酒酒精度在6.8%vol～8.8%vol之間，總酯含量在（0.46～1.48）g/100mL之間，棗香、酒香較淡，酒質(zhì)較粗糙。因此，確定最適料液比為1∶3（g∶mL）。

表3 料液比對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響Table 3 Effect of material to liquid ratio on jujube fruit wine fermentation

2.5.2 發(fā)酵溫度對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響

以總酯含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，發(fā)酵溫度對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響見(jiàn)表4。

表4 不同發(fā)酵溫度對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響Table 4 Effect of different fermentation temperature on jujube fruit wine fermentation

低溫更有利于產(chǎn)酯酵母發(fā)酵，從而提高果酒品質(zhì)[35]；但是溫度過(guò)低也會(huì)影響酵母的繁殖和代謝速度。由表4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為24～26 ℃時(shí)，發(fā)酵液中的酒精含量偏低，為7.6%vol～8.9%vol，棗香濃郁，酒香較淡，口感偏甜；當(dāng)發(fā)酵溫度為28～32 ℃時(shí)，發(fā)酵液中的酒精含量為10.8%vol～11.2%vol，總酯含量為（1.42～1.68）g/100 mL，果香、酒香愉悅和諧，滋味可口，無(wú)苦味。26～28 ℃發(fā)酵條件下的總酯含量明顯高于32 ℃發(fā)酵溫度下的，推測(cè)可能是略低的發(fā)酵溫度適合酯類物質(zhì)的生成，當(dāng)發(fā)酵溫度高于28 ℃會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)酯酵母的產(chǎn)酶活力降低，不利于產(chǎn)酯酵母代謝，果酒品質(zhì)也相應(yīng)降低[35-36]。因此，確定最適發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.5.3 毛榛畢赤酵母Y14接種量對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響

以總酯含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，毛榛畢赤酵母Y14接種量對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響見(jiàn)表5。

表5 不同毛榛畢赤酵母Y14接種量對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響Table 5 Effect of different Pichia manshurica inoculum on jujube fruit wine fermentation

由表5可知，P.manshuricaY14接種量過(guò)低，發(fā)酵啟動(dòng)慢，24 h后接種的安琪果酒專用酵母快速繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌，會(huì)對(duì)P.manshuricaY14的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性的抑制作用，發(fā)酵液中也會(huì)積累大量的酒精，抑制了P.manshuricaY14的繁殖及代謝，不利于提高發(fā)酵液中的總酯含量。當(dāng)P.manshuricaY14接種量為6%～8%時(shí)，木棗果酒的酒精度為10.0%vol～10.2%vol，總酯含量為（1.64～1.68）g/100 mL，果香、酒香愉悅和諧，口感較好。繼續(xù)加大P.manshuricaY14的接種量，一方面酵母快速繁殖消耗了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，酒體含糖量降低；另一方面可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中溶氧不足，進(jìn)而對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生抑制作用，不利于香氣物質(zhì)的形成，導(dǎo)致口感變差。因此，確定最適P.manshuricaY14的接種量為6%。

2.5.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響

以總酯含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，發(fā)酵時(shí)間對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響見(jiàn)表6。

表6 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)木棗果酒發(fā)酵的影響Table 6 Effect of different fermentation time on jujube fruit wine fermentation

由表6可知，不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)木棗果酒酒精度的影響不大。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5～6 d時(shí)，木棗果酒中的果香和酒香較淡，酒味略重，口感較差，推測(cè)可能是果酒中的酯類、有機(jī)酸、多糖、氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)尚未完全生成，發(fā)酵不徹底所致[37]；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為7 d時(shí)，木棗果酒中的總酯含量為1.62 g/100 mL，果香和酒香逐漸協(xié)調(diào)一致，酒體豐滿，酸甜可口，同時(shí)果酒的酒度達(dá)到最大值11.0%vol；隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)（9 d），木棗果酒的酒精度略有所降低，此時(shí)應(yīng)結(jié)束發(fā)酵。因此，確定最適發(fā)酵時(shí)間為7 d。同時(shí)，考慮到發(fā)酵時(shí)間對(duì)木棗果酒酒精度的影響并不明顯，故而在響應(yīng)面試驗(yàn)中發(fā)酵時(shí)間不作為考察因子進(jìn)行考慮。

2.5.5 木棗果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

（1）回歸模型的建立及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表7，方差分析見(jiàn)表8。

采用軟件Design-Expert 8.0.6對(duì)表7的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到二次回歸方程為：

由表8回歸方程的方差分析結(jié)果可知，兩個(gè)模型均極顯著（P＜0.01），且失擬項(xiàng)均不顯著（P=0.29/0.055＞0.05），說(shuō)明此兩個(gè)模型是可靠的；變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=2.09%/9.38%，較小，說(shuō)明試驗(yàn)操作可信；酒精度和總酯含量的校正決定系數(shù)R2Adj=0.948 5/0.900 0，表明94.85%/90.00%的響應(yīng)值變化是由所選變量引起的，決定系數(shù)R2=0.977 5/0.956 2與R2Adj較接近，說(shuō)明模型擬合程度較好，誤差較小，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化建立的木棗果酒發(fā)酵工藝回歸方程（模型）是有效的。

表7 木棗果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Design and results of response surface experiments for jujube fruit wine fermentation process optimization

表8 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 8 Variance analysis of response surface experiments results

以酒精度為響應(yīng)值時(shí)，一次項(xiàng)A、B和二次項(xiàng)A2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB、AC、BC影響顯著（P＜0.05），由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為A＞B＞C；以總酯含量為響應(yīng)值時(shí)，一次項(xiàng)A、C和二次項(xiàng)A2、B2影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B影響顯著（P＜0.05），由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為A＞C＞B。

（2）響應(yīng)曲面分析

3個(gè)因素對(duì)指標(biāo)影響的響應(yīng)面結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可直觀地看出料液比、P.manshuricaY14接種量和發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)酒精含量（Y1）和總酯含量（Y2）的影響程度。響應(yīng)面的陡峭程度，表示兩個(gè)因素之間的交互作用是否明顯。在Y1模型中AB、AC、BC交互作用顯著，等高線呈現(xiàn)橢圓形，存在極值，曲面較為陡峭，交互作用顯著；在Y2模型中，AB、AC、BC交互作用不顯著，與表8中的方差分析結(jié)果一致。

圖9 料液比、接種量和發(fā)酵溫度交互作用對(duì)酒精度（a）及總酯含量（b）影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines for effects of interaction between material-liquid ratio,inoculum and fermentation temperature on alcohol content (a) and total ester content (b)

（3）驗(yàn)證試驗(yàn)

以總酯含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)回歸擬合方程2得到的木棗果酒最優(yōu)發(fā)酵條件為料液比1.0∶2.8（g∶mL），毛榛畢赤酵母接種量6.2%，發(fā)酵溫度28.3 ℃，預(yù)測(cè)的總酯含量為1.67 g/100 mL，酒精度為10.8%vol。實(shí)際發(fā)酵中為操作方便調(diào)整為料液比1∶3（g∶mL），順序接種毛榛畢赤酵母Y14 6%、安琪果酒專用酵母0.5%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵周期7 d，在優(yōu)化得出的最佳條件下做3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，獲得木棗果酒的總酯含量為（1.68±0.02）g/100 mL，酒精度為（10.5±0.12）%vol，與理論預(yù)測(cè)值接近。成品果酒的顏色呈琥珀色，棗香、酒香濃郁清新，酒體豐滿醇厚，酸甜可口。因此，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化所得的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，模型合理可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

采用純培養(yǎng)技術(shù)從山西老陳醋酒醪中共分離到23株酵母菌，通過(guò)產(chǎn)酯性能測(cè)試，初篩出1株產(chǎn)酯能力最強(qiáng)的菌株Y14，總酯產(chǎn)量為（38.52±0.19）g/L，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其為毛榛畢赤酵母（Pichia manshurica）。菌株Y14的環(huán)境耐受性分析結(jié)果表明，菌株Y14可在乙醇體積分?jǐn)?shù)8%、pH值2.5～4.5、糖度35 °Bx、SO2200 mg/L和最高溫度不超過(guò)39 ℃的環(huán)境中生存。將P.manshuricaY14應(yīng)用于木棗果酒發(fā)酵，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析，獲得木棗果酒的最適發(fā)酵工藝為料液比1∶3（g∶mL），P.manshuricaY14和安琪果酒專用酵母的順序接種量分別為6%和0.5%，發(fā)酵溫度28 ℃，周期7 d。制成的木棗果酒酒精度為（10.5±0.12）%vol，總酯含量為（1.68±0.02）g/100 mL，有明顯的棗香氣，濃郁清新，酒體豐滿醇厚，酸甜可口。