趙 倩，謝全喜，徐海燕，谷 巍，曹 斌，鄭軍紅

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271000）

殼聚糖是一種廣泛存在于自然界中，由蝦、蟹、昆蟲(chóng)的幾丁質(zhì)外殼經(jīng)過(guò)不同程度地脫乙?；玫降囊环N無(wú)毒聚氨基葡萄糖[1]。殼寡糖（β-1,4-寡糖-葡萄糖胺）是殼聚糖經(jīng)物理、化學(xué)或特殊的生物酶降解得到的一種聚合度在2～20之間的寡糖產(chǎn)品，其水溶性好、功能作用大和生物活性高[2]。殼寡糖是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基寡糖，綠色天然、無(wú)副作用，已經(jīng)成為國(guó)際上新興的功能性低聚糖。殼寡糖由于易于吸收，功效顯著，已經(jīng)作為生物保鮮劑[3-4]和飼料添加劑[5]廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥領(lǐng)域、食品領(lǐng)域、化妝品領(lǐng)域和水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域等，主要用于降血脂、抗癌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等[6]。

楊煥蝶等[7]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）具有較好的抑菌作用，且較低的乙酰度和pH值更有利于殼聚糖發(fā)揮其抑菌活性。錢(qián)建瑛等[8]研究發(fā)現(xiàn)，降低pH值、提高脫乙酰度和提高殼寡糖溶液濃度等能夠提高殼寡糖的抑菌活性。目前，殼寡糖作為功能性低聚糖也被廣泛應(yīng)用在畜禽養(yǎng)殖中，研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖能夠增殖有益菌，抑制有害菌生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)機(jī)體腸道微生態(tài)平衡。殼寡糖的抗菌性能是光譜性的，已有不少學(xué)者對(duì)其抑菌抗菌[9]、抗病毒[10]和抗腫瘤[11]等進(jìn)行了研究。馮文娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌（Candida albicans）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有良好的抑菌活性，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）均為6.5 g/L；對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC和MBC均為1.5 g/L；錢(qián)建瑛等[8]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)殼寡糖質(zhì)量濃度＞5 mg/mL之后，抑菌效果與同質(zhì)量濃度苯甲酸鈉相近，降低pH值、提高脫乙酰度、提高殼寡糖溶液質(zhì)量濃度等都能提高殼寡糖的抑菌活性。目前，隨著國(guó)家對(duì)抗生素的使用要求越來(lái)越嚴(yán)格以及環(huán)保的壓力，在畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域，殼寡糖作為一種天然的免疫增強(qiáng)和炎癥調(diào)節(jié)活性物質(zhì)，在增強(qiáng)動(dòng)物免疫機(jī)能和抗炎方面具有較高的價(jià)值和應(yīng)用前景[1]。

本研究采用牛津杯法和共培養(yǎng)法研究殼寡糖對(duì)雞源、豬源大腸桿菌和沙門(mén)氏菌（Salmonella）的抑菌作用以及殼寡糖對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響，以期為開(kāi)發(fā)殼寡糖和乳酸菌復(fù)合產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

殼寡糖（聚合度2～10，分子質(zhì)量≤2 000 Da，純度為80%）：山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司；氯化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、木糖賴氨酸去氧膽酸鹽（xylose lysine deoxycholate，XLD）瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 菌株

病原菌（雞源大腸桿菌菌株BLCC8-0102、雞源沙門(mén)氏菌菌株BLCC8-0104、豬源大腸桿菌菌株BLCC8-0001和豬源沙門(mén)氏菌菌株BLCC8-0063）：從患病畜禽病料中分離、鑒定，保存于本實(shí)驗(yàn)室；乳酸菌菌株BLCC2-0015和BLCC2-0126：山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2F（2）超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：常州諾基儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；THZ-C恒溫振蕩器：揚(yáng)州培英實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛津杯法測(cè)定殼寡糖對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌作用

分別將大腸桿菌和沙門(mén)氏菌以無(wú)菌操作稀釋一定倍數(shù)，取0.1 mL均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，放入牛津杯，每個(gè)杯中分別注入質(zhì)量濃度為0.02 g/mL、0.10 g/mL、0.20 g/mL和0.50 g/mL的殼寡糖溶液0.2 mL，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，設(shè)置營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為陰性對(duì)照[13]。

藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)抑菌圈直徑＞15 mm時(shí)為高敏；介于10～15 mm之間時(shí)為中敏；＜10 mm時(shí)為低敏[14]。

1.3.2 共培養(yǎng)法檢測(cè)殼寡糖對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌作用

病原菌菌液的制備：從斜面挑取1環(huán)病原菌菌苔接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，裝液量為50 mL/250 mL，于37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，備用。

在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0（空白組）、0.02 g/mL、0.10 g/mL、0.20 g/mL和0.50 g/mL的殼寡糖，同時(shí)按1%（V/V）的接種量接入培養(yǎng)好的病原菌菌液，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，分別于2 h和8 h取樣檢測(cè)病原菌活菌數(shù)，大腸桿菌接種于伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；沙門(mén)氏菌接種于XLD培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。大腸桿菌按照GB/T 18869—2002《飼料中大腸菌群的測(cè)定》進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；沙門(mén)氏菌按照GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.3 殼寡糖對(duì)乳酸菌的抑菌作用

乳酸菌菌液的制備：從斜面上挑取1環(huán)乳酸菌菌苔接種到MRS肉湯培養(yǎng)基，裝液量為250 mL/250 mL，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，備用。

在MRS肉湯培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0（空白組）、0.2 g/mL和1.0 g/mL的殼寡糖，同時(shí)按照2%（V/V）的接種量接入上述準(zhǔn)備好的乳酸菌菌液，于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h和24 h時(shí)取樣檢測(cè)乳酸菌活菌數(shù)，檢測(cè)方法按照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2013軟件進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，最小顯著差異（least significant difference，LSD）法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌作用

2.1.1 牛津杯法檢測(cè)殼寡糖對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌作用

采用牛津杯法檢測(cè)殼寡糖對(duì)雞源和豬源大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌作用，均未檢測(cè)到抑菌圈。

2.1.2 共培養(yǎng)法檢測(cè)殼寡糖對(duì)雞源大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌作用

沙門(mén)氏菌和大腸桿菌是兩種重要的人畜共患病致病菌，嚴(yán)重威脅畜禽健康、食品安全、人類(lèi)健康和公共安全。大腸桿菌普遍存在于人類(lèi)和畜禽腸道內(nèi)，大部分血清型作為腸道內(nèi)的共生菌是沒(méi)有毒性的，僅少數(shù)血清型的大腸桿菌具有致病性，可引起嚴(yán)重的腸道感染，給畜禽業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[15]。我國(guó)沙門(mén)氏菌有290多種血清型，不同血清型的沙門(mén)氏菌的致病性存在差異，能夠引起傷寒、副傷寒以及胃腸道疾病等。我國(guó)每年因沙門(mén)氏菌食物中毒的發(fā)病人數(shù)達(dá)300萬(wàn)人次，其中近半數(shù)與生雞肉交叉污染有關(guān)[16]。殼寡糖具有良好的藥理學(xué)作用和安全性以及多種有益的生物學(xué)活性，其中對(duì)炎性信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制被認(rèn)為是其發(fā)揮抗炎作用的主要機(jī)制[1]。采用共培養(yǎng)法檢測(cè)殼寡糖對(duì)雞源大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 殼寡糖對(duì)雞源大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑制作用Table 1 Inhibition of oligochitosan on Escherichia coli and Salmonella from chicken

由表1可知，殼寡糖對(duì)雞源大腸桿菌的抑制作用：培養(yǎng)2 h時(shí)，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 g/mL質(zhì)量濃度外，大腸桿菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；培養(yǎng)8 h時(shí)，與空白組相比，4個(gè)殼寡糖組大腸桿菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05），且隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強(qiáng)。殼寡糖對(duì)雞源沙門(mén)氏菌的抑制作用：培養(yǎng)2 h時(shí)，與空白組相比，4個(gè)殼寡糖組沙門(mén)氏菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05），且隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強(qiáng)；培養(yǎng)8 h時(shí)，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 g/mL質(zhì)量濃度外，沙門(mén)氏菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)，在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行殼寡糖的抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌等有害菌具有抑制作用[17]。本試驗(yàn)結(jié)果與已有研究一致，殼寡糖在抑制大腸桿菌和沙門(mén)氏菌方面效果顯著，具有抗炎作用。

2.1.3 共培養(yǎng)法檢測(cè)殼寡糖對(duì)豬源大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌作用

表2 殼寡糖對(duì)豬源大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑制作用Table 2 Inhibition of oligochitosan on Escherichia coli and Salmonella from pig

由表2可知，殼寡糖對(duì)豬源大腸桿菌的抑制作用：培養(yǎng)2 h時(shí)，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 g/mL質(zhì)量濃度外，大腸桿菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；培養(yǎng)8 h時(shí)，與空白組相比，4個(gè)殼寡糖組大腸桿菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。殼寡糖對(duì)豬源沙門(mén)氏菌的抑制作用：培養(yǎng)2 h時(shí)，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 g/mL質(zhì)量濃度外，沙門(mén)氏菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；培養(yǎng)8 h時(shí)，與空白組相比，4個(gè)殼寡糖組大腸桿菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05），且隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強(qiáng)。

2.2 殼寡糖對(duì)乳酸菌的抑制作用

大量研究表明，殼寡糖能夠改善動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[18]。乳酸菌在調(diào)節(jié)免疫功能方面的機(jī)制尚不完全清楚，但其具有與有害菌競(jìng)爭(zhēng)性排斥、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功能[19]。目前，關(guān)于殼寡糖對(duì)乳酸菌抑制作用的報(bào)道較少，祁東風(fēng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖可抑制有害菌增殖，增加優(yōu)勢(shì)菌群含量。但紀(jì)小敏等[21]研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖對(duì)保加利亞乳桿菌（Lactobacil-lus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的生長(zhǎng)活性具有一定的抑制作用。本試驗(yàn)通過(guò)共培養(yǎng)法檢測(cè)殼寡糖對(duì)乳酸菌的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 殼寡糖對(duì)乳酸菌活菌數(shù)的影響Table 3 Effect of oligochitosan on the viable lactic acid bacteria count

由表3可知，殼寡糖對(duì)乳酸菌BLCC2-0015的抑制作用：培養(yǎng)8 h時(shí)，與空白組相比，殼寡糖的添加，使得乳酸菌活菌數(shù)顯著降低（P＜0.05）；培養(yǎng)24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，添加0.20 g/mL的殼寡糖對(duì)乳酸菌活菌數(shù)影響不顯著（P＞0.05），添加0.50g/mL的殼寡糖可顯著降低乳酸菌活菌數(shù)（P＜0.05）。殼寡糖對(duì)乳酸菌BLCC2-0126的抑制作用：培養(yǎng)8 h和24 h時(shí)，空白組相比，添加0.2 g/mL的殼寡糖對(duì)照乳酸菌活菌數(shù)影響不顯著（P＞0.05），添加0.50 g/mL的殼寡糖顯著降低乳酸菌活菌數(shù)（P＜0.05）。劉媛媛等[2]研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖能增加斷奶仔豬有益微生物數(shù)量。但也有研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加250 mg/kg的殼寡糖能降低回腸中乳酸桿菌和大腸桿菌數(shù)量，顯著降低乳酸濃度[22]。本研究中0.5 g/mL的殼寡糖對(duì)乳酸菌具有抑制作用，0.2 g/mL的殼寡糖與乳酸菌共培養(yǎng)24 h時(shí)對(duì)乳酸菌活菌數(shù)沒(méi)有影響，不具備抑制作用，說(shuō)明0.2 g/mL的殼寡糖與乳酸菌可以共同使用，不會(huì)產(chǎn)生抑制作用。

3 結(jié)論

牛津杯法未檢測(cè)出殼寡糖對(duì)病原菌的抑制作用；共培養(yǎng)法證實(shí)質(zhì)量濃度為0.1 g/mL、0.2 g/mL和0.5 g/mL的殼寡糖對(duì)雞源、豬源大腸桿菌和沙門(mén)氏菌均具有顯著的抑菌作用（P＜0.05），且隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強(qiáng)；0.2 g/mL殼寡糖與乳酸菌共培養(yǎng)24 h對(duì)乳酸菌活菌數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。