王思遠，趙梓月，穆利霞，鄒宇曉，廖森泰，王衛(wèi)飛

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東 廣州 510610)

目前，市場上的補鈣產(chǎn)品主要有以碳酸鈣為代表的無機鈣和以葡萄糖酸鈣、乳酸鈣和檸檬酸鈣等為代表的有機鈣，這些產(chǎn)品普遍存在結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和生物利用率低等問題[1]。研究發(fā)現(xiàn)，一些來自食物中的多肽可與鈣、鐵、鋅等二價金屬離子結(jié)合形成配位鍵，所生成的金屬螯合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易吸收，從而可促進礦物元素的吸收和利用[2-3]。多肽與鈣結(jié)合的機制主要有磷酸基團- 鈣、羧基- 鈣兩種模式。酪蛋白磷酸肽(CPPs)是目前為止發(fā)現(xiàn)的促鈣吸收效果最好的短肽，已作為鈣強化劑廣泛應(yīng)用于嬰幼兒食品及其他補鈣類功能食品中。研究表明，當(dāng)對CPPs進行脫磷處理后，其結(jié)合鈣活性基本喪失，充分說明了磷酸基團在與鈣結(jié)合中的重要作用[4]。

蛋白的化學(xué)改性是利用多肽的羧基、氨基、羥基等活性基團發(fā)生水解、烷基化、?；⒘姿峄确磻?yīng)，通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、電荷、疏水基團等，達到改變蛋白質(zhì)的功能特性[5]。蛋白化學(xué)改性具有反應(yīng)簡單、應(yīng)用廣泛和效果顯著等特點。磷酸化修飾被證明是可以提高食品蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的比較重要和有效的改性修飾技術(shù)[6]：如Yu等[7]研究了三聚磷酸鈉改性制備磷酸化改性花生分離蛋白，改性后樣品的溶解性、乳化活性、起泡性、持水性和吸油性等理化特性均有所改善；Enomoto等[8]通過對α-乳清蛋白進行磷酸化修飾，對脂肪的抗氧化能力和免疫活性等均有提高。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者致力于尋找高效、低成本的多肽材料，已從多種食品蛋白，如大豆、南極磷蝦、太平洋鱈魚、烏鱧等[9-12]中制備出金屬螯合肽，并發(fā)現(xiàn)這些肽類在改善鈣等二價礦物元素生物利用度方面具有極大的潛力。本研究團隊前期開發(fā)了一種蠶蛹多肽結(jié)合鈣，該產(chǎn)品可溶性好，含鈣量高。本研究擬利用磷酸化試劑對蠶蛹多肽進行磷酸化改性，考察磷酸化蠶蛹多肽的結(jié)合鈣能力與結(jié)構(gòu)變化，并對磷酸化反應(yīng)的工藝進行優(yōu)化，希望通過增加磷酸化位點，進一步提高多肽的結(jié)合鈣能力，為多肽結(jié)合鈣補鈣制劑的開發(fā)提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮削絲蠶蛹(兩廣2號)，廣東韶關(guān)翁源縣真誠意蠶桑專業(yè)合作社。

Alcalase酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，諾維信(中國) 生物技術(shù)有限公司；石油醚、鹽酸、無水乙醇、檸檬酸鈉、Na2S、CaCl2、NaCl、Na3PO4、NaH2PO4、(NaPO3)6，均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；NaOH、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，分析純，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；絡(luò)黑T，分析純，天津市天新精細化工開發(fā)中心；KH2PO4，分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CR 22GⅢ型高速冷凍離心機，日本日立公司；FD5508型真空冷凍干燥機，韓國ilshin公司；Nicolet IS5型傅立葉紅外光譜儀、EASY-nLC 1000型高效液相色譜儀、Orbitrap Elite型質(zhì)譜儀，美國Thermo Scientific公司；XL-30-ESEM型掃描電子顯微鏡，荷蘭FEI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1蠶蛹多肽的制備

取新鮮蠶蛹，沸水漂燙2 min，在60 ℃烘箱中烘干，粉碎過40目篩，加入石油醚脫脂，制得脫脂蠶蛹粉。取一定質(zhì)量的脫脂蠶蛹粉，加蒸餾水配制成質(zhì)量分數(shù)10%的溶液，再加入Alcalase酶酶解4 h，沸水中滅酶5 min，離心取上清液制得蠶蛹多肽溶液。

1.3.2多肽結(jié)合鈣復(fù)合物的制備

本研究團隊前期已確定了多肽結(jié)合鈣復(fù)合物的制備條件[13]，具體工藝如下：

取1.3.1中已經(jīng)制備的蠶蛹多肽溶液，按肽鈣質(zhì)量比3.4∶1.0加入CaCl2。調(diào)節(jié)溶液pH值為10，73 ℃反應(yīng)80 min，加入4倍體積95%乙醇溶液進行沉淀，離心后取沉淀，冷凍干燥后得蠶蛹多肽給合鈣復(fù)合物。

1.3.3磷酸化改性蠶蛹多肽結(jié)合鈣復(fù)合物的制備

本研究團隊前期通過單因素實驗，以鈣結(jié)合量為指標(biāo)，分別采用反應(yīng)溫度(30、40、50、60 ℃)、反應(yīng)時間(0.5、1、2、3 h)和pH值(6、7、8、9、10)，考察不同磷酸化反應(yīng)條件對蠶蛹多肽結(jié)合鈣含量的影響，確定了多肽磷酸化處理的優(yōu)化條件為：pH值8，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時間1 h。

磷酸化改性蠶蛹多肽結(jié)合鈣復(fù)合物的制備：取1.3.1中蠶蛹多肽溶液，加入適量磷酸化試劑，調(diào)節(jié)pH值為8，40 ℃恒溫水浴反應(yīng)1 h，按肽鈣質(zhì)量比3.4∶1.0加入CaCl2，調(diào)節(jié)pH值為10，73 ℃反應(yīng)80 min，加入4倍體積95%乙醇溶液進行沉淀，離心后取沉淀，冷凍干燥后得磷酸化蠶蛹多肽結(jié)合鈣復(fù)合物。

1.3.4磷酸化試劑對蠶蛹多肽結(jié)合鈣含量的影響實驗

分別采用0.1 mol/L的Na3PO4、NaH2PO4、(NaPO3)6作為磷酸化試劑，考察不同磷酸化試劑對蠶蛹多肽結(jié)合鈣含量的影響。

分別采用質(zhì)量分數(shù)為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%的NaH2PO4作為磷酸化試劑，考察不同添加量的磷酸化試劑對蠶蛹多肽結(jié)合鈣含量的影響。

1.3.5鈣含量測定

參照GB/T 5009.92—2016 中的EDTA滴定法。

1.3.6磷標(biāo)準曲線繪制與磷含量測定

準確吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL磷標(biāo)準使用液，分別置于25 mL容量瓶中。依次加入2 mL鉬酸銨溶液(50 g/L)，搖勻靜置30 s。加入1 mL亞硫酸鈉溶液(200 g/L)、1 mL對苯二酚溶液(5 g/L)后定容、搖勻。靜置0.5 h后，在660 nm處測定溶液吸光度，繪制標(biāo)準曲線(見圖1)，回歸方程為y=0.004 6x+0.000 2，R2=0.999 5，其中，y為吸光值，x為含磷量。

圖1 磷標(biāo)準曲線Fig.1 Standard curve of phosphorus

1.3.7產(chǎn)品結(jié)構(gòu)表征

蠶蛹多肽分子中含有羧基、羥基、氨基等基團，為研究磷酸化處理后，蠶蛹多肽的結(jié)構(gòu)變化，探索肽鈣結(jié)合方式，對蠶蛹多肽結(jié)合鈣復(fù)合物和磷酸化蠶蛹多肽結(jié)合鈣復(fù)合物樣品進行紅外光譜分析和磷酸化修飾的位點檢測。

1.3.7.1 紅外光譜分析

取磷酸化蠶蛹多肽結(jié)合鈣復(fù)合物樣品，在波數(shù)為4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)進行紅外光譜分析。

1.3.7.2 磷酸化位點檢測

取蠶蛹多肽結(jié)合鈣復(fù)合物和磷酸化蠶蛹多肽結(jié)合鈣復(fù)合物樣品各2 mg，加入500 μL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的甲酸溶液，置于振蕩器上振蕩至兩種樣品全部溶解。取20 μL 完全溶解的樣品，使用100%乙腈活化除鹽柱進行洗脫，將洗脫溶液離心濃縮干燥，去除乙腈，真空干燥后取1～2 μg樣品上機。用液相色譜儀進行分離，使用自填的 Trap 柱(C18，5 μm，100 μm×2 cm)和分析柱(C18，1.9或2.4 μm，75 μm×20 cm)，流速為200 nL/min。串聯(lián)質(zhì)譜檢測采用的是數(shù)據(jù)依賴掃描(data dependent acquisition，DDA)模式。全掃分辨率為60 000 (FWHM)，質(zhì)荷比范圍設(shè)定為m/z350～1 600，HCD碎裂模式下，碰撞能量設(shè)置35%。

1.3.8掃描電鏡分析

取一定量蠶蛹多肽、蠶蛹多肽結(jié)合鈣復(fù)合物和磷酸化蠶蛹多肽結(jié)合鈣復(fù)合物樣品，將樣品抖落至樣盤雙面膠上，經(jīng)過噴金鍍膜處理后放入掃描電鏡抽真空，施加一定電壓后，在放大1 000倍數(shù)下獲取掃描圖像。電鏡掃描條件設(shè)定為：高壓5.00 kV，束流6.9×10-2mA，工作距離8.5 mm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復(fù)3次及以上，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準誤差(mean±SD)表示，應(yīng)用EXCEL軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷酸化試劑的改性作用及對蠶蛹多肽結(jié)合鈣能力的影響

不同磷酸化試劑的磷酸化作用及對肽鈣結(jié)合的影響，實驗結(jié)果如表1。表1顯示：對照組的磷含量為37.26 mg/g,表明蠶蛹多肽中已含有少量磷酸基團；磷酸化處理后，樣品中磷和鈣的質(zhì)量分數(shù)顯著高于未改性組，說明這些多肽中的某些基團被磷酸化了，且引入的磷酸基團又與鈣離子發(fā)生了結(jié)合；不同于磷酸試劑處理蠶蛹多肽，改性后制得的多肽結(jié)合鈣樣品的鈣、磷含量無顯著差異，表明這3種試劑對蠶蛹多肽的磷酸化作用相近。從食品安全和成本角度綜合考慮，選擇NaH2PO4為改性蠶蛹多肽制備肽鈣復(fù)合物的磷酸化試劑。

表1 不同磷酸化試劑對磷酸化蠶蛹多肽結(jié)合鈣中的鈣與磷含量的影響Tab.1 Effect of different kinds phosphorylation reagents on content of calcium and phosphorus of phosphorylated silkworm pupa polypeptide-calcium complex mg/g

2.2 磷酸化水平對蠶蛹多肽結(jié)合鈣能力的影響

采用不同質(zhì)量分數(shù)的NaH2PO4對蠶蛹多肽進行改性，進一步分析制備出的多肽結(jié)合鈣樣品中的鈣含量與磷含量，結(jié)果如表2。表2顯示：隨著NaH2PO4濃度不斷增加，蠶蛹多肽結(jié)合鈣中的磷含量不斷升高，但鈣含量隨著磷含量的升高呈先升高后下降的趨勢；當(dāng)采用質(zhì)量分數(shù)為0.50%的NaH2PO4作為磷酸化試劑時，多肽結(jié)合鈣中磷的質(zhì)量分數(shù)為116.41 mg/g，結(jié)合鈣質(zhì)量分數(shù)達到最大，為202.32 mg/g。

表2 NaH2PO4添加量對制得的蠶蛹多肽結(jié)合鈣中的鈣與磷含量的影響Tab.2 Effect of different addition of NaH2PO4 on content of calcium and phosphorus of phosphorylated silkworm pupa polypeptide-caciam complex mg/g

結(jié)果表明，多肽磷酸化改性后可提高與鈣的結(jié)合率，但鈣結(jié)合能力并不與引入的磷酸基團呈正相關(guān)性，適宜程度的磷酸化水平更有利于多肽與鈣相結(jié)合。本研究結(jié)果與相關(guān)報道一致，如Jiang等[14]利用胰蛋白酶水解卵黃高磷蛋白后，用堿法脫磷將卵黃磷蛋白磷酸肽(PPPs)處理成17.5%～96.3%不同磷酸化程度的多肽，發(fā)現(xiàn)含35%磷酸化的PPPs對增強鈣結(jié)合能力和抑制不溶性磷酸鈣的形成是最有效的。

2.3 磷酸化改性對蠶蛹多肽結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1磷酸化位點檢測結(jié)果

磷酸化位點檢測結(jié)果見表3。表3顯示，蠶蛹多肽結(jié)合鈣中共鑒定出4個磷酸化位點，改性后，有17種肽段被磷酸化，增加磷酸化位點22個。磷酸化修飾主要發(fā)生在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Try)兩種氨基酸上，磷酸化試劑能夠與 Ser和Try的—OH發(fā)生親核加成反應(yīng)[15]，使磷酸基團接枝到多肽分子上，多肽再通過磷酸基團與Ca2+結(jié)合。

表3 磷酸化蠶蛹多肽結(jié)合鈣中磷酸化修飾的位點信息Tab.3 Phosphorylation sites of phosphorylated silkworm pupa polypeptide-calcium complex

2.3.2紅外光譜分析結(jié)果

圖2 不同質(zhì)量分數(shù)的NaH2PO4處理制得的蠶蛹多肽結(jié)合鈣紅外光譜Fig.2 Infrared spectrum of silkworm pupa polypeptide binding calcium with different mass fraction of NaH2PO4

2.3.3磷酸化蠶蛹多肽的肽鈣結(jié)合模式分析

多肽主要通過磷酸基團和羧基等活性基團與鈣結(jié)合。酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶消化后生成酪蛋白多肽衍生物并被磷酸化，即生成CPPs，實際上是一系列含有磷酸絲氨酸簇的短肽-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-[18]。Ferraretto等[19]發(fā)現(xiàn)，CPPs核心序列上的磷酸絲氨酸殘基可與鈣結(jié)合形成Ca3(PO4)2納米團簇，從而聚集鈣離子并引起細胞對鈣的攝取。從動物體中制備出的具有促進鈣吸收作用的非磷酸化肽，主要通過所含谷氨酸(Asp)和天冬氨酸(Glu)上的羧基與鈣結(jié)合。Bao等[20]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白肽(SPHs)的鈣結(jié)合能力與羧基基團呈線性相關(guān)，并且最可能的鈣結(jié)合位點是Asp和Glu的羧基。蠶蛹中蛋白質(zhì)含量約為12%～16%，具有良好的氨基酸配比，且Asp和Glu含量最高，分別可達到總氨基酸的10%和14%左右[21]，可提供豐富的肽- 鈣結(jié)合位點。Chen等[22]發(fā)現(xiàn)，鈣離子可通過單配位基模式、雙配位基模式和α模式與多肽結(jié)合。綜合磷酸化位點檢測結(jié)果和紅外光譜分析結(jié)果，推測磷酸化蠶蛹多肽的肽鈣結(jié)合模式如圖3。

圖3 磷酸化蠶蛹多肽的肽鈣結(jié)合模式Fig.3 Binding mechanism of calcium and phosphorylated silkworm pupa polypeptide

2.4 掃描電鏡分析結(jié)果

圖4為蠶蛹多肽、肽鈣復(fù)合物以及磷酸化改性后肽鈣復(fù)合物的掃描電鏡分析結(jié)果。由圖4可看出，蠶蛹多肽表面光滑，結(jié)構(gòu)緊實；蠶蛹多肽結(jié)合鈣表面疏松多孔，與Wu等[23]制備的膠原多肽結(jié)合鈣類似，這種結(jié)構(gòu)有利于溶解吸收；磷酸化處理后，其表面更加致密了，可能與其結(jié)合鈣含量較高有關(guān)。

圖4 多肽與肽鈣復(fù)合物的掃描電鏡分析結(jié)果Fig.4 Results of SEM analysis of peptide and calcium-peptide complex

3 結(jié) 論

本研究利用Na3PO4、NaH2PO4、(NaPO3)6等3種試劑對多肽進行磷酸化改性，再制備多肽- 鈣復(fù)合物。改性后多肽的鈣結(jié)合率顯著提高，且3種磷酸化試劑所制備樣品的鈣結(jié)合率無顯著性差異。選擇NaH2PO4為磷酸化試劑，蠶蛹多肽結(jié)合鈣中的磷含量隨著NaH2PO4添加量的增加而不斷升高，但鈣含量呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)NaH2PO4質(zhì)量分數(shù)為0.50%時，磷含量為116.41 mg/g，結(jié)合鈣含量達到最大值，為202.32 mg/g。蠶蛹酶解產(chǎn)物中有17種肽段被磷酸化，增加磷酸化位點22個，主要是肽段中Ser、Thr的—OH與磷酸基團反應(yīng)，從而增加與鈣離子的結(jié)合位點。

本研究開發(fā)了一種蠶蛹多肽的磷酸化改性方法，發(fā)現(xiàn)適宜程度的磷酸化水平的多肽結(jié)合鈣能力更強，希望該方法能夠應(yīng)用于其他多肽材料中，為進一步開發(fā)出高效的補鈣制品提供理論參考和實踐指導(dǎo)。