李 曉，盧學(xué)春，李雨鑫，劉馨竹，杜培革，安麗萍，*

(1.北華大學(xué) 藥學(xué)院，吉林省 吉林市 132013；2.中國人民解放軍總醫(yī)院 血液科，北京 100853)

姬松茸(AgaricusblazeiMurill,ABM)，又稱巴西蘑菇、小松菇、柏氏蘑菇，是一種食藥兼用的名貴真菌[1]，姬松茸多糖(Agaricusblazeipolysaccharide,ABP)是其主要活性成分之一。ABP具有抗氧化、降血脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等[2-4]多種作用。

高脂血癥是一種常見和多發(fā)的脂代謝異常性疾病，可以引發(fā)脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病等，嚴(yán)重危害人類身體健康[5]。高脂血癥的發(fā)生是由于脂肪的代謝或者轉(zhuǎn)運(yùn)異常，使血清中一種或者多種脂質(zhì)高于正常范圍，主要是以總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低為主要特征[6]。調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝對(duì)預(yù)防和治療高脂血癥尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物中含有大量具有降血脂作用的物質(zhì)，以天然產(chǎn)物中活性成分預(yù)防高脂血癥及相關(guān)疾病已成為現(xiàn)代生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[7]。大量研究表明，ABP具有降血脂活性，但是真菌多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)和構(gòu)象在很大程度上決定其生物活性。本研究團(tuán)隊(duì)前期工作證明，ABP在體外具有抗氧化作用，可以減少油酸誘導(dǎo)的HepG2高脂細(xì)胞模型內(nèi)脂滴堆積，降低細(xì)胞內(nèi)TC和TG含量，說明ABP可能具有調(diào)節(jié)血脂的作用，但其具體降血脂成分和機(jī)制尚不明確。

本研究擬提取分離ABP，并對(duì)其進(jìn)行DEAE-纖維素離子交換柱層析分級(jí)，得到進(jìn)一步純化的姬松茸酸性多糖級(jí)分(ABP-A)，利用高脂飲食誘導(dǎo)高脂血癥大鼠模型，從生化指標(biāo)、肝臟病理變化及肝臟代謝因子的表達(dá)水平，初步探討ABP-A降血脂的作用及機(jī)制。希望為進(jìn)一步開發(fā)姬松茸相關(guān)功能食品和藥品提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論參考，促進(jìn)姬松茸的深度開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，32只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK(吉)-2016-0003。姬松茸，江蘇省蘇威微生物研究有限公司，北華大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定為姬松茸(AgaricusblazeiMurill,ABM)的干燥子實(shí)體；基礎(chǔ)飼料，長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司；DEAE-纖維素、瓊脂糖凝膠CL-6B，美國Sigma-Aldrich公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；TC、TG、HDL-C、LDL-C ELISA試劑盒，武漢愛博泰克生物科技有限公司；低密度脂蛋白(LDL-R)、固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白(SREBP-1C)、膽固醇7a-羥化酶(CYP7a-1)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)、B類清道夫F(SCARB-1F)、GAPGH引物，北京鼎盛昌盛生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒、One Step RT-PCR Kit試劑盒，諾唯贊生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.1.2儀器與設(shè)備

BenchTop Pro型臺(tái)式冷凍干燥機(jī)，美國Virtis公司；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)、LC-16型高效液相色譜儀，島津國際貿(mào)易有限公司；Infinite M200型酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；A200型PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；Champchemi Basic型全自動(dòng)熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1姬松茸多糖的提取及含量測(cè)定

將姬松茸子實(shí)體常溫粉碎，過60目篩，按料液比1∶20(g∶mL)加入蒸餾水浸泡過夜，100 ℃浸提3 h，重復(fù)3次，過濾并合并濾液，于 60 ℃真空減壓濃縮；加入4倍體積的無水乙醇沉淀過夜，沉淀物用乙醇洗后烘干，得到姬松茸粗多糖；蒸餾水溶解粗多糖后，用截留分子質(zhì)量為3 500 Da的透析袋，于蒸餾水中透析48 h以除去小分子物質(zhì)，-80 ℃冷凍干燥，得到精制后的ABP。分別采用苯酚- 硫酸法[8]、間羥基聯(lián)苯法[9]、考馬斯亮藍(lán)法[10]分析ABP中糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)的含量，測(cè)定樣品中灰分含量[11]。單糖成分分析采用HPLC系統(tǒng)(LC-10ATVP泵和SPD-10AVD紫外光檢測(cè)器)，Inertsil ODS-35色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為磷酸緩沖鹽溶液(PBS 0.1 mol/L，pH值7.0)-乙腈(二者體積比為82∶18)，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm[12-13]。

1.2.2姬松茸多糖的分離純化

稱取8 g ABP樣品，配制成質(zhì)量濃度為8 mg/mL的溶液，磁力攪拌過夜，使其充分溶解。將樣品溶液以4 000 r/min離心15 min，取上清液，利用平衡好的DEAE-纖維素柱(7.5 cm×30 cm，Cl-型)進(jìn)行分級(jí)，用0.5 mol/L NaCl溶液洗脫。利用截留分子質(zhì)量為3 000 Da的中空纖維柱除去洗脫液鹽離子，于60 ℃真空減壓濃縮，-80 ℃冷凍干燥。

1.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及給藥

雄性Wistar大鼠32只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，溫度20.0～22.0 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。將大鼠隨機(jī)分成4組，即空白對(duì)照組(NG)、模型組(MG)、辛伐他汀陽性對(duì)照組(PG)、姬松茸多糖組(ABP-A)，每組8只。NG組飼喂基礎(chǔ)飼料100(g/kg)·d-1，MG、PG、ABP-A組飼喂高脂飼料100(g/kg)·d-1，自由飲水。建立模型的同時(shí)灌胃給藥，PG組給予4.8(mg/kg)·d-1辛伐他汀水溶液，ABP-A組給予640(mg/kg)·d-1ABP-A提取物水溶液，NG與MG組給予等體積蒸餾水，連續(xù)42 d。

1.2.4大鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)的測(cè)定

每周固定時(shí)間記錄各組大鼠體質(zhì)量及其變化情況。末次給藥后，當(dāng)晚禁食不禁水，于次日上午，腹腔注射5%水合氯醛(0.75 mL/100 g)，待大鼠麻醉后準(zhǔn)確稱量麻醉完全的大鼠體質(zhì)量和大鼠肝臟濕質(zhì)量并詳細(xì)記錄，計(jì)算肝臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值。見式(1)。

臟器指數(shù)=臟器濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100% 。

(1)

式(1)中，臟器濕質(zhì)量，mg；體質(zhì)量，g。

1.2.5血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的測(cè)定

大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min分離血清。參照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的方法測(cè)定大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。

1.2.6肝臟組織HE染色

大鼠肝臟浸于10%福爾馬林中固定1周，蘇木精- 伊紅染色法(hematoxylineosin staining,HE)染色[14]。

1.2.7肝臟組織中LDL-R、SREBP-1C、CYP7a-1、PPAR-α、SCARB-1F的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

取15 mg肝臟提取總RNA并定量，每組各取2 μg逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電壓80 V，時(shí)間45 min。

電泳完成后利用凝膠成像儀采集圖像，Image J計(jì)算熒光強(qiáng)度值，以GAPGH為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。表1為L(zhǎng)DL-R、SREBP-1C、CYP7a-1、PPAR-α、SCARB-1F的引物序列。

表1 LDL-R、SREBP-1C、CYP7a-1、PPAR-α、SCARB-1F的引物序列Tab.1 Primer sequence of LDL-R，SREBP-1C，CYP7a-1， PPAR-α，SCARB-1F

1.3數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 姬松茸多糖的成分及含量分析

表2為ABP的成分分析結(jié)果。由表2可見：ABP中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為751 mg/g，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19 mg/g，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為56 mg/g。圖1為ABP的單糖組成的HPLC分析結(jié)果，對(duì)圖1中各峰面積進(jìn)行計(jì)算，得表3(ABP的單糖含量分析結(jié)果)。由表3可見：ABP的單糖組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為葡萄糖(Glc)(600 mg/g)、半乳糖(Gal)(284 mg/g)、甘露糖(Man)(62 mg/g)、鼠李糖(Rha)(4 mg/g)、半乳糖醛酸(GalA)(1 mg/g)、木糖(Xyl)(12 mg/g)、阿拉伯糖(Ara)(1 mg/g)、巖藻糖(Fuc)(36 mg/g)。

圖1 ABP的單糖組成HPLC分析結(jié)果Fig.1 Results of monosaccharide composition of ABP by HPLC

表2 ABP的成分分析結(jié)果Tab.2 Results of component analysis of ABP mg/g

表3 ABP的單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.3 Monosaccharide content of ABP mg/g

2.2 姬松茸多糖的分離純化結(jié)果分析

利用DEAE-纖維素柱對(duì)ABP進(jìn)行離子交換層析分級(jí)。用0.5 mol/L NaCl 溶液洗脫得到酸性糖級(jí)分ABP-A，以試管編號(hào)為橫坐標(biāo)，以490 nm處吸光度值為縱坐標(biāo)，得到如圖2所示的洗脫曲線。表4為ABP-A的成分分析結(jié)果，由表4可見：ABP-A 的得率為47.5%，ABP-A中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為741 mg/g，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為182 mg/g，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48 mg/g。圖3為ABP-A的單糖組成HPLC分析結(jié)果，對(duì)圖3中各峰面積進(jìn)行計(jì)算，得表5(ABP-A的單糖含量)。由表5可見：ABP-A的單糖組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為Glc(886 mg/g)、Gal(24 mg/g)、Man(19 mg/g)、Rha(10 mg/g)、GalA(5 mg/g)、Xyl(19 mg/g)、Ara(21 mg/g)、Fuc(16 mg/g)。

圖2 ABP經(jīng) DEAE-纖維素柱后的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of ABP after DEAE-cellulose column

表4 ABP-A的成分分析結(jié)果Tab.4 Results of component analysis of ABP-A mg/g

圖3 ABP-A的單糖組成HPLC分析結(jié)果Fig.3 Results of monosaccharide composition of ABP-A by HPLC

表5 ABP-A的單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.5 Monosaccharide content of ABP-A mg/g

2.3 ABP-A對(duì)高脂血癥大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量的影響

圖4為ABP-A與大鼠體質(zhì)量變化關(guān)系的分析結(jié)果，由圖4可見：NG組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)，與NG組相比，MG組大鼠造模第4周后體質(zhì)量顯著增長(zhǎng)(P<0.05)；與MG組相比，PG組大鼠和ABP-A組大鼠分別從造模后第4周和第5周后體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，增長(zhǎng)趨勢(shì)緩慢。

圖5為大鼠相對(duì)肝臟指數(shù)隨ABP-A干預(yù)的變化情況，由圖5可見：與NG組相比，MG組大鼠的相對(duì)肝臟指數(shù)極顯著升高(P<0.01)；與MG相比，ABP-A組相對(duì)肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)。

2.4 ABP-A對(duì)高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的影響

圖6為大鼠血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果，由圖6可見：與NG組相比，MG組大鼠血清TC、TG、LDL-C含量極顯著上升(P<0.01)，HDL-C含量極顯著下降(P<0.01)；與MG組相比，ABP-A組大鼠血清TC、TG、LDL-C含量極顯著降低(P<0.01)，HDL-C含量極顯著升高(P<0.01)。

*表示與NG組相比差異顯著 (P<0.05)，#表示與MG組相比差異顯著(P<0.05)，▲表示差異極顯著(P<0.01)。圖4 ABP-A對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of ABP-A on body weight of rats

*表示與NG組相比差異顯著 (P<0.05)，** 表示差異極顯著 (P<0.01)；#表示與MG組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。圖5 ABP-A對(duì)高脂血癥大鼠相對(duì)肝臟指數(shù)的影響Fig.5 Effect of ABP-A on relative liver index in hyperlipidemia rats

*表示與NG組相比差異顯著(P<0.05)，** 表示差異極顯著(P<0.01)；#表示與MG組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。圖6 ABP-A對(duì)高脂血癥大鼠血清生化指標(biāo)的影響Fig.6 Effect of ABP-A on serum biochemical parameters in hyperlipidemia rats

2.5 ABP-A對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織的影響

圖7為大鼠肝細(xì)胞HE染色結(jié)果，由圖7可見：NG組[圖7(a)]肝組織排列整齊，細(xì)胞核清晰可見，肝組織結(jié)構(gòu)較完整；MG組[圖7(b)]肝細(xì)胞體積變大，可見廣泛的肝細(xì)胞脂肪變性，有大量脂滴沉積；PG組[圖7(c)]，肝細(xì)胞排列緊致，形態(tài)恢復(fù)正常，細(xì)胞內(nèi)脂滴消失；ABP-A組[圖7(d)]肝細(xì)胞排列及結(jié)構(gòu)整齊，未見細(xì)胞內(nèi)存在脂滴。

2.6 ABP-A對(duì)高脂血癥大鼠肝臟中mRNA表達(dá)量的影響

放大倍數(shù)：40倍。圖7 大鼠肝臟組織病理學(xué)變化Fig.7 Histopathological changes in rat liver

圖8為大鼠肝臟組織中mRNA表達(dá)量分析結(jié)果。圖8(a)為RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝臟中mRNA表達(dá)結(jié)果，使用Image J對(duì)圖8(a)進(jìn)行灰度分析，得出圖8(b)至圖8(f)。由圖8可見：與NG組相比，MG組的SCARB-1F mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，LDL-R、CYP7a-1、PPAR-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，SREBP-1C mRNA的相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與MG組相比，ABP-A組的LDL-R、SCARB-1F mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，CYP7a-1、PPAR-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，SREBP-1C mRNA的相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。

3 結(jié) 論

肝臟是機(jī)體內(nèi)參與脂質(zhì)代謝的重要器官，研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期飼喂高脂飲食會(huì)引起肝臟組織腫大[15-16]。本實(shí)驗(yàn)利用高脂飲食誘導(dǎo)建立高脂血癥大鼠模型，MG組大鼠的肝臟指數(shù)，血清TC、TG、LDL-C顯著升高，說明高脂大鼠模型建立成功。ABP-A干預(yù)后大鼠血清TC、TG、LDL-C顯著降低，HDL-C顯著升高，肝臟細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積減少，提示ABP-A具有降低高脂血癥大鼠血脂作用。

機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝的過程極其復(fù)雜，受多種因素共同調(diào)節(jié)，維持機(jī)體脂類代謝的穩(wěn)態(tài)依賴于脂質(zhì)的合成、吸收及排泄這3條主要代謝途徑[17]。PPAR-α高表達(dá)于肝臟，能與脂肪酸及其衍生物結(jié)合并活化，減少肝臟中脂質(zhì)積累，從而啟動(dòng)一系列與脂質(zhì)代謝有關(guān)的酶的轉(zhuǎn)錄，對(duì)維持脂質(zhì)代謝的平衡起著十分重要的調(diào)節(jié)作用[18-19]。PPAR-α能通過誘導(dǎo)肝X受體的表達(dá)引起CYP7a-1表達(dá)的上調(diào)[20]。CYP7a-1是肝臟TC代謝為膽汁酸的第一步限速酶，催化TC分解為膽汁酸，主要分布于肝臟，在維持脂質(zhì)代謝的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[21-22]。TC在機(jī)體內(nèi)能夠被徹底氧化分解，主要是通過細(xì)胞膜表面的LDL-R對(duì)外源性膽固醇的內(nèi)吞作用，將其吸收入細(xì)胞內(nèi)，并轉(zhuǎn)化為類固醇激素等，起到維持人體生理功能的作用[23-24]。CYP7a-1基因的表達(dá)上調(diào)可以增加LDL-R的表達(dá)，進(jìn)而影響TC和脂蛋白的代謝，加速TC轉(zhuǎn)化為膽汁酸的代謝過程[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ABP-A干預(yù)后高脂大鼠肝臟中LDL-R、CYP7a-1、PPAR-α因子表達(dá)上調(diào)。SREBP-1C的靶基因是控制脂肪酸合成的限速酶，脂肪酸及其部分代謝產(chǎn)物是具有肝細(xì)胞毒性的分子，作用于肝細(xì)胞可引起線粒體腫脹和通透性增加，肝細(xì)胞變性、壞死和炎細(xì)胞浸潤而誘發(fā)脂肪性肝炎[26]。SCARB-1F是清道夫受體蛋白的B類家族的成員，是一種具有特殊功能的膜蛋白，主要在肝臟中表達(dá)，在介導(dǎo)選擇性脂質(zhì)攝取并且在逆向轉(zhuǎn)運(yùn)TC中起關(guān)鍵作用[27-28]，能夠直接與多種蛋白質(zhì)和脂質(zhì)發(fā)生作用。SREBP-1C過度表達(dá)可以引起SCARB-1F表達(dá)的下調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ABP-A干預(yù)后能下調(diào)高脂血癥大鼠肝臟中SREBP-1C的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)SCARB-1F的表達(dá)，因此，提示ABP-A可以減少脂質(zhì)在肝臟中積累，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂，有明顯的降脂作用。

*表示與NG組相比差異顯著 (P<0.05)，**表示差異極顯著 (P<0.01)；#表示與MG組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。圖8 ABP-A對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織中mRNA表達(dá)量的影響Fig.8 Effect of ABP-A on mRNA expression in liver tissue of rats with hyperlipidemia

本研究證實(shí)ABP-A對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠有顯著的降血脂作用，作用機(jī)制與其對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝關(guān)鍵因子LDL-R、SREBP-1C、CYP7a-1、PPAR-α、SCARB-1F的調(diào)控有關(guān)。希望本研究可為進(jìn)一步開展姬松茸降血脂功能食品和藥品的研發(fā)提供理論參考。