牛云蔚,李雯慧,肖作兵
(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 香料香精化妝品學(xué)部,上海 201418)
白酒是中國的國酒。我國白酒歷史悠久,早在西漢時(shí)期便被記錄在冊。白酒是世界上最受歡迎的6種蒸餾酒之一,與威士忌、白蘭地、伏特加、杜松子酒和朗姆酒并列。糧谷經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵,通過蒸餾、貯存以及勾調(diào)孕育出了不同香型白酒。醬香型、濃香型、清香型、米香型是白酒的基本香型,在4種基本香型的基礎(chǔ)上衍生出來的香型有芝麻香型、藥香型、兼香型、老白干香型、鳳香型、豉香型、馥郁香型以及特型[1]。
白酒中的風(fēng)味物質(zhì)與人體健康之間存在復(fù)雜的關(guān)系。高傳強(qiáng)研究發(fā)現(xiàn)芝麻香型白酒中3-甲硫基乙酸乙酯、3-甲硫基丙醇和3-甲硫基丙酸乙酯等含硫化合物會(huì)抑制α-葡萄糖苷酶活性,一定程度上會(huì)有降低血糖的作用[2]。白酒中的多元醇可促進(jìn)膽汁和胰腺分泌,可輔助降血壓,還能夠通便、預(yù)防便秘[3]。楊濤等[4]使用Anin體外模型研究了與白酒相關(guān)的健康因素,發(fā)現(xiàn)吡嗪類化合物(主要是川芎嗪)與抗氧化活性、增強(qiáng)免疫力有關(guān)。一些臨床數(shù)據(jù)顯示,適量飲用白酒可以改善循環(huán)系統(tǒng)和心血管的功能[5],還可以減少血栓的形成,預(yù)防動(dòng)脈硬化[6]。白酒產(chǎn)生獨(dú)特的香氣是由于白酒中風(fēng)味物質(zhì)的不同配比,但如白酒中醛類含量過高會(huì)對人的口腔和食道粘膜有很大刺激,也會(huì)增加機(jī)體的氧化壓力[7]。此外,白酒釀造過程也會(huì)產(chǎn)生一些不利于白酒風(fēng)味的物質(zhì),甚至有些物質(zhì)會(huì)對人體健康有損害[8]。
白酒中物質(zhì)的含量、化學(xué)性質(zhì)、極性、沸點(diǎn)、溶解度和揮發(fā)度都差異較大,沒有固定的前處理方法同時(shí)分析所有物質(zhì),需要結(jié)合不同的前處理方法和分析儀器從而確定香氣物質(zhì)對白酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)。白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究的前處理方法主要有液- 液萃取(liquid liquid extraction,LLE)、攪拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction,SBSE)、分散液- 液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)、固相萃取(solid-phase extraction,SPE)、溶劑輔助風(fēng)味揮發(fā)萃取(solvent assisted flavor evaporation,SAFE)、頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)和超臨界二氧化碳萃取等。
白酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物使用的分析儀器主要有氣相色譜- 氫火焰離子化檢測器(gas chromatography-flame ionization detector,GC-FID)、氣相色譜- 火焰光度檢測器(gas chromatography-flame photometric detector,GC-FPD)、氣相色譜- 氮磷檢測器(gas chromatography-nitrogen phosphorous detection,GC-NPD)、氣相色譜- 質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、二維氣相色譜- 質(zhì)譜(two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry,GC/GC-MS)、多維氣相色譜- 質(zhì)譜(multi-dimensional gas chromatography-mass spectrometry,MDGC-MS)等。白酒的揮發(fā)性風(fēng)味化合物具有成分復(fù)雜、含量低的特性,應(yīng)選擇合適的分析技術(shù)進(jìn)行組合。例如,HS-SPME聯(lián)用GC-MS用于揮發(fā)性風(fēng)味化合物的分析,DLLME聯(lián)用液相色譜- 質(zhì)譜用于難揮發(fā)性風(fēng)味化合物和大分子物質(zhì)的分析。
近年來,人們使用了許多方法和儀器來鑒定揮發(fā)性風(fēng)味化合物。白酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的定性方法主要有:標(biāo)準(zhǔn)品比較法、保留指數(shù)(retention index,RI)、GC-MS、氣相色譜- 嗅聞法(gas chromatography-olfactometry,GC-O)等。應(yīng)用上述前處理方法,分析儀器和定性方法,可以在白酒中鑒定出多種微量、不穩(wěn)定、低閾值的化合物,如含硫、含氮化合物等。然而,單一的方法是有局限性的,應(yīng)多種分析方法相結(jié)合增加分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
白酒的定量方法主要有歸一化定量法、峰高百分比法、峰面積百分比法、外標(biāo)法(external standard method,ESTD)、內(nèi)標(biāo)法(internal standard method,ISTD)和穩(wěn)定同位素稀釋法(stable isotope dilution analysis,SIDA)。ESTD是通過稀釋樣品中的每個(gè)組分所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),得到不同的濃度梯度,在同樣的色譜條件下進(jìn)樣,一系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線由此產(chǎn)生,這樣就可以求出樣品中各組分的實(shí)際含量,校正檢測器對不同化合物的響應(yīng),在不受其他化合物影響的情況下,結(jié)果準(zhǔn)確,該方法對前處理、進(jìn)樣量和儀器狀態(tài)有較高的要求。ISTD是要避免因外界因素產(chǎn)生的誤差,所以在樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),但是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的加入也會(huì)引起測量的峰面積不準(zhǔn)確,SIDA雖然精密度和準(zhǔn)確度都很高,可是同位素內(nèi)標(biāo)物不容易獲得,大部分要人工合成,但SIDA可能是長期的定量發(fā)展方向。
已報(bào)道的白酒揮發(fā)性化合物有1 870多種,包括酯、內(nèi)酯、醇、縮醛、酮、酸、芳香族、雜環(huán)、醛、含氮化合物、萜類和含硫化合物[9]。Fan等[10]采用HS-SPME和GC-O相結(jié)合的方法對洋河大曲的新鮮白酒和陳年白酒的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進(jìn)行了研究,GC-MS和GC-O對香氣物質(zhì)定性,且均為雙柱定性。研究結(jié)果顯示:丁酸乙酯,己酸乙酯以及丙酸乙酯在洋河大曲中有很高的風(fēng)味稀釋因子,且酯類化合物是其主要風(fēng)味成分。聶慶慶等[11]通過LLE結(jié)合GC-O、GC-MS對綿柔型白酒中的香氣成分鑒定,結(jié)果表明:己酸乙酯是最重要的香氣成分,其次是己酸、三甲基吡嗪、丁酸乙酯和γ-壬內(nèi)酯。Niu等[12]用GC-O和GC-FPD方法對清香型白酒的香氣成分進(jìn)行了分析,共檢測出80種揮發(fā)性風(fēng)味化合物,其中含硫化合物10種。
白酒中的釀造微生物作為白酒釀造過程中的發(fā)酵源,能產(chǎn)生多種風(fēng)味化合物,如有機(jī)酸、酯類、醇類、內(nèi)酯類、酚類、雜環(huán)類、萜類、芳香類化合物、氨基酸和小肽等,白酒中非揮發(fā)性風(fēng)味化合物通常對白酒味覺、口感、健康功能都有影響。
由于白酒中的非揮發(fā)性組分的含量較少,在進(jìn)行樣品前處理時(shí)通常使用衍生化方法。如果揮發(fā)性物質(zhì)的干擾比較大,待測樣品濃度太低,一般會(huì)先進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),把揮發(fā)性物質(zhì)去除,或者使用吸附劑吸附、真空凍干、直接真空凍干、溫和氮?dú)獯蹈蒣13-15]等方法去除香氣成分的干擾[16]。通常使用離子色譜法[17-18]、高效液相色譜法、超高效液相色譜法和核磁共振法[19]等對非揮發(fā)性組分進(jìn)行檢測。但是對于含量較低的非揮發(fā)性組分,需要用衍生化- 氣相色譜法[20-22],衍生劑分為烷基化試劑、酰基化試劑、硅烷化試劑、其他衍生試劑。最常用的衍生劑是三甲基硅烷(trimethylsilyl,TMS)[23]、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺[N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide,BSTFA][24]、N-甲基-N-叔丁基二甲基硅三氟乙酰胺(N-methyl-N-tert-butyldimethylsilyltrifluoracetamide,MTBSTFA)[25-26]、六甲基二硅氮烷(hexamethyldisilazane,HMDS)[27]、三甲基氯硅烷(trimethylchlorosilane,TMCS)。白酒大曲中MTBSTFA作為衍生劑可以檢測到9種不揮發(fā)性有機(jī)酸,21種氨基酸,2種多元醇以及6種其他類化合物[25]。在8種香型白酒(清香型、濃香型、醬香型、芝麻香型、鳳香型、豉香型、特型和老白干香型)中BSTFA作為衍生劑檢測到48種不揮發(fā)物質(zhì),其中包括 28 種不揮發(fā)有機(jī)酸、4 種氨基酸、15 種多羥基化合物和 1 種其他類不揮發(fā)物質(zhì)[28]。在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下,衍生劑可以取代分子中如羧基、羥基、氨基、巰基等活性氫,對含有極性基團(tuán)的分子,衍生化后的分子揮發(fā)性和穩(wěn)定性均有很大提高。
白酒中已檢測到游離氨基酸18種,包括組氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丙氨酸、絡(luò)氨酸、纈氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸[29]。而氨基酸的呈味特征非常復(fù)雜,有些呈甜味,有些呈鮮味,酸味,苦味等[30]。白酒含有的小肽包括環(huán)狀二肽、二肽、三肽和四肽,白酒中發(fā)現(xiàn)的具有不同生理和藥理活性的小肽使其不同于世界上其他蒸餾酒[31-35]。常見的非揮發(fā)性不飽和脂肪酸主要包括油酸,十六碳烯酸和亞麻酸等,非揮發(fā)性有機(jī)酸主要包括:二元脂肪酸、羰基脂肪酸、羥基脂肪酸、C12以上的直鏈脂肪酸等[36]。白酒中的非揮發(fā)性醇主要包括高級醇和多元醇,有研究通過離子色譜法對白酒中的多元醇進(jìn)行了測定,且建立了甘油、葡萄糖和鼠李糖等多元醇的定量分析方法[37]。白酒中的非揮發(fā)性酯類主要是棕櫚酸乙酯、內(nèi)酯、苯乙酸異丁酯、肉豆蔻酸乙酯、硬脂酸乙酯和苯乙酸乙酯等芳香族酯。Zhou等[38]建立了一種重現(xiàn)性好、抗干擾能力強(qiáng)、快速的GC-MS測定白酒中棕櫚酸乙酯的方法。然而,由于白酒中非揮發(fā)性酯類化合物的含量低、沸點(diǎn)高,大多數(shù)非揮發(fā)性酯類化合物在氣相色譜中的響應(yīng)值很低。白酒中芳香酯的HPLC-QQQ分析方法可以同時(shí)檢測白酒中各種芳香酯的含量,為白酒中芳香物質(zhì)的檢測提供了一種很好的方法[39]。傅玉書等[14]利用TMS衍生結(jié)合GC-MS的方法分析了茅臺(tái)酒中的非揮發(fā)性酚類化合物,從中測出了11種非揮發(fā)性酚類化合物,分別是對香草酸、羥基苯甲醛、間羥基苯乙酮、對羥基苯甲酸、對羥基苯乙酸、鄰羥基苯丙酸、水楊酸、香草醛、4-羥基-3-甲氧基苯丙酸、鄰羥基苯乙酸、對羥基苯丙酸。
目前關(guān)于白酒中香氣成分之間相互作用的研究方法主要有S型曲線法、OAV法、σ-τ圖法、分配系數(shù)法、矢量模型法以及PDE模型法等。
研究發(fā)現(xiàn)香氣化合物或香氣化合物的混合物的對數(shù)濃度與檢測概率存在一定的關(guān)系[40-44],心理測量的濃度反應(yīng)函數(shù)是符合S型曲線的,函數(shù)公式見式(1)。
(1)
式(1)中,C代表了待測樣品的嗅覺閾值[用log(μg/L)表示];x代表了待測樣品試驗(yàn)濃度[用log(μg/L)表示];D代表了每種待測樣品的參數(shù)特征,它決定了函數(shù)的斜率;P代表了嗅覺的檢測概率,應(yīng)該使用校正因子P=(3×p-1)/2來校正實(shí)際的檢測概率(p為每個(gè)濃度的實(shí)際檢測概率)。
當(dāng)P=0.5時(shí),則為待測樣品的檢測閾值濃度。使用Feller加合模型[45]來求出混合物的理論檢測概率,F(xiàn)eller加合公式見式(2)。
P(AB)=P(A)+P(B)-P(A)P(B) 。
(2)
式(2)中,P(AB)是混合物的理論嗅覺檢測概率,P(A)和P(B)分別是待測組分A、B的嗅覺檢測概率。香氣物質(zhì)間的相互作用要用理論閾值與實(shí)驗(yàn)閾值的比值判定,記R為該比值,當(dāng)R≤0.5時(shí),協(xié)同作用效果;0.5
用X表示混合物的理論OAV以及實(shí)測OAV之間的比值,從而來判斷組分之間的相互作用效果[49-50]。混合物中各個(gè)組分的OAV之和則為理論OAV;而實(shí)測OAV是通過混合物濃度和實(shí)驗(yàn)閾值的比值來求出。X的計(jì)算公式見式(3)。
(3)
式(3)中,OAVmix是混合物的實(shí)測OAV,∑OAVi是混合物的理論OAV,Ti和Ci為混合物中第i個(gè)組分的閾值和濃度,Tmix為混合物的閾值。當(dāng)X≤0.5時(shí),表現(xiàn)為協(xié)同作用效果;X>1時(shí),表現(xiàn)為掩蓋作用效果;X=1時(shí),表現(xiàn)為無作用效果;0.5 σ-τ圖法是Patte和Laffort提出的σ=F(τ)模型[54]。通過對A、B化合物單獨(dú)存在時(shí)的香氣強(qiáng)度與它們混合物的香氣強(qiáng)度進(jìn)行比較,來判斷A、B之間香氣強(qiáng)度的關(guān)系和影響。σ表示混合物的香氣強(qiáng)度及A、B單獨(dú)存在時(shí)香氣強(qiáng)度的和的比值,函數(shù)公式見式(4)。 (4) 式(4)中,IAB是混合物的香氣強(qiáng)度,IA和IB則分別是組分A,B的香氣強(qiáng)度。單個(gè)組分的香氣強(qiáng)度與各組分單獨(dú)存在時(shí)香氣強(qiáng)度的和的比值用τ表示,函數(shù)公式見式(5)。 (5) 當(dāng)σ<1時(shí),表現(xiàn)為低加成作用效果。低加成作用效果又有以下3種情況:1)當(dāng)IAB 分配系數(shù)法是由Ettre等[57]用來解釋香氣物質(zhì)的釋放以及保留現(xiàn)象,這種方法基于物理化學(xué)的性質(zhì),利用動(dòng)力學(xué),熱力學(xué)等手段來研究白酒香氣組分的氣液平衡,函數(shù)方程見式(6)。 (6) (7) 矢量模型法可以直接研究香氣物質(zhì)間的相互作用,便于尋找香氣物質(zhì)之間的作用規(guī)律。矢量模型認(rèn)為混合物香氣強(qiáng)度等于混合前各組分香氣強(qiáng)度的矢量和[59],函數(shù)公式見式(8)。 (8) 式(8)中,IAB是混合物的香氣強(qiáng)度;IA和IB代表了組分的香氣強(qiáng)度;α是與組分A、B感知相互作用相關(guān)的常數(shù)。當(dāng)IA和IB相等時(shí),矢量模型可簡化為式(9)。 (9) 此時(shí)混合物的香氣強(qiáng)度與組分的香氣強(qiáng)度之和存在線性關(guān)系,選一些等香氣強(qiáng)度的點(diǎn)測定混合物的香氣強(qiáng)度,可以根據(jù)擬合的線性斜率得出α。混合物的理論香氣強(qiáng)度等于未混合組分表示組分的香氣強(qiáng)度之和,根據(jù)式(8)可求出混合物的實(shí)際香氣強(qiáng)度,若混合物理論香氣強(qiáng)度大于實(shí)際香氣強(qiáng)度,則為掩蓋作用,混合物理論香氣強(qiáng)度小于實(shí)際香氣強(qiáng)度,則為協(xié)同作用。劉影[60]將乙酸乙酯、己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、苯乙酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯兩兩混合,利用矢量模型研究表明,混合物的香氣強(qiáng)度與單個(gè)組分的香氣強(qiáng)度之和存在良好的線性關(guān)系。 偏微分方程(partial differential equation,PDE)模型不僅可以分析香氣之間的相互作用關(guān)系,還可以預(yù)測強(qiáng)度,函數(shù)公式見式(10)至式(13)[61-62]。 OIm=OI/(lnOAVa+lnOAVb) 。 (10) Xa=lnOAVa/(lnOAVa+lnOAVb) 。 (11) OIa,m=f(1)=(1-x′)·f′(x′)+y′ 。 (12) OIb,m=f(0)=-x′·f′(x′)+y′ 。 (13) 上述公式中a和b是不同的香氣化合物,OI代表混合物的總香氣強(qiáng)度,OIm代表每lnOAV單位物質(zhì)的平均香氣強(qiáng)度,Xa是組分a的比例。以O(shè)Im為縱坐標(biāo)軸,Xa為橫坐標(biāo)軸,建立擬合曲線,在該曲線(x,y)某點(diǎn)處做切線,切線在縱坐標(biāo)軸上得到兩個(gè)截距,就可以得到OIa ,m和OIb,m。OIa,m(或OIb,m)表示每個(gè)lnOAV單元物質(zhì)a(或物質(zhì)b)的香氣強(qiáng)度實(shí)際上對整個(gè)香氣混合物的貢獻(xiàn)。劉影[60]用PDE模型和σ-τ圖法研究了分子結(jié)構(gòu)相似的醇類化合物(己醇和丁醇)和醛類化合物(2-甲基丁醛和3-甲基丁醛)之間的相互作用,結(jié)果表明PDE模型中香氣化合物對混合物香氣強(qiáng)度的影響和香氣化合物在混合物中的比例成正比,且PDE模型對混合物中的香氣強(qiáng)度有很好的預(yù)測性能。 就食品風(fēng)味感知而言,白酒獨(dú)特香氣特征的物質(zhì)基礎(chǔ)在于揮發(fā)性風(fēng)味化合物,然而有些非揮發(fā)性風(fēng)味化合物會(huì)影響揮發(fā)性風(fēng)味化合物的釋放,甚至通過與揮發(fā)性風(fēng)味化合物相互作用影響著白酒的整體香氣特征。Zhang等[63]報(bào)道了劍南春白酒中一種非揮發(fā)性環(huán)八肽,在液體樣品中添加該環(huán)八肽會(huì)對頂空濃度產(chǎn)生顯著抑制作用,影響最大的是該環(huán)八肽和酚類化合物(苯酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚)之間的相互作用,而酯類、醇類、醛類和揮發(fā)性酸類的影響不大。熱力學(xué)分析表明該環(huán)八肽與酚類化合物之間的主要作用力是氫鍵。Huang等[64]研究了中國芝麻香型白酒分離得到的多肽與香氣物質(zhì)的結(jié)合能力,多肽能夠選擇性的影響白酒中揮發(fā)性小分子化合物的揮發(fā)性能,酯類、醇類和酚類化合物的揮發(fā)性影響較大,通過HS-SPME-GC-MS、紫外吸收光譜和核磁共振波譜分析表明:多肽AKRA與對甲苯酚發(fā)生了氫鍵作用,減少了對甲苯酚的揮發(fā)性,從而降低了由此帶來的異嗅味,且進(jìn)一步確認(rèn)了AKRA 與對甲苯酚的結(jié)合位點(diǎn)位于 AKRA 結(jié)構(gòu)中的羰基氧與對甲苯酚酚羥基氫之間。 對白酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物和非揮發(fā)性風(fēng)味化合物的分析方法,以及白酒中風(fēng)味化合物相互作用的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了探討。白酒中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物之間會(huì)產(chǎn)生加成作用、協(xié)同作用、掩蓋作用或無相互作用,分析這些相互作用的方法有很多,主要有S型曲線法、OAV法、σ-τ圖法、分配系數(shù)法、矢量模型法以及PDE模型法。有研究通過S型曲線法表明烷基硫醚對醬香型白酒的水果香味有協(xié)同作用等;通過OAV法對茅臺(tái)酒的研究表明:己酸乙酯與乳酸乙酯,乙酸乙酯這兩組混合物分發(fā)生了協(xié)同作用等,而乙酸乙酯和乳酸乙酯的混合物發(fā)生了加成作用等;用σ-τ圖法分析了清香型白酒中醛酮類物質(zhì)和醇類間相互作用,醇類物質(zhì)基本發(fā)生掩蓋作用,而己醇和苯甲醇則不發(fā)生相互作用,醛酮類物質(zhì)發(fā)生協(xié)同作用等;通過分配系數(shù)法發(fā)現(xiàn)白酒中高濃度的2-苯乙醇和1-丙醇可以抑制3-甲基丁酸的釋放,并且1-丙醇對3-甲基丁酸的影響要大于2-苯乙醇等;利用矢量模型法研究發(fā)現(xiàn):混合物的香氣強(qiáng)度與單個(gè)組分的香氣強(qiáng)度之和存在良好的線性關(guān)系等;PDE模型法對白酒中混合物的香氣強(qiáng)度有很好的預(yù)測性能。每種方法都有自己的優(yōu)缺點(diǎn),相互驗(yàn)證會(huì)使研究結(jié)果更準(zhǔn)確。 白酒中非揮發(fā)性風(fēng)味化合物可以和揮發(fā)性風(fēng)味化合物發(fā)生相互作用,改變揮發(fā)性風(fēng)味化合物的分配系數(shù),從而引起白酒香氣的變化,影響白酒的味道和口感屬性。未來,除應(yīng)繼續(xù)深入探討白酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物之間的相互作用關(guān)系,還應(yīng)從白酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物與非揮發(fā)性風(fēng)味化合物相互作用、非揮發(fā)性風(fēng)味化合物之間的相互作用及它們對白酒味道和口感屬性的影響方面繼續(xù)開展研究。3.3 σ-τ圖法
3.4 分配系數(shù)法
3.5 矢量模型法
3.6 PDE模型法
4 結(jié)論與展望