余清，吳寧，賈世軍，姚宇琪，侯俊，董浩

618000 四川 德陽，德陽市人民醫(yī)院 病理科(余清、吳寧)；610041 成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學醫(yī)學院 病理科(賈世軍、姚宇琪、侯俊、董浩)

文獻報道[1-3]宮頸鱗狀上皮病變的發(fā)病率逐年降低，而宮頸腺癌的發(fā)病率則呈上升趨勢，在宮頸癌中的比例由5%升至20%左右，液基細胞學(liquid-based cytology test，LCT)識別鱗狀上皮病變的特異性較高，對腺上皮病變的診斷準確性卻較低[4]。細胞塊技術的基本原理是將細胞懸浮液離心，得到高度濃縮的細胞和微小的組織塊，使用或不使用細胞塊支架,再經10%中性福爾馬林固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、染色。細胞塊比細胞涂片收集到更多的細胞成分,能恢復一定程度的組織學結構,且更清楚地顯示腫瘤細胞的形態(tài)結構及細胞核的異型特征，制成的蠟塊可以連續(xù)切片并長期保存,在細胞塊基礎上還可以進行免疫細胞化學(immunocytochemistry，ICC)標記和基因檢測。目前細胞塊常被用于非婦科細胞學檢查，用于宮頸腺上皮病變的文獻報道較少。本文以此為背景，探討在LCT基礎上加做細胞塊及ICC檢測在診斷宮頸腺上皮病變中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年1～12月LCT診斷腺上皮細胞異常病例共302例，均制備細胞塊，其中來自四川省腫瘤醫(yī)院172例，四川省德陽市人民醫(yī)院130例，患者年齡31～74歲，平均(50.93±13.57)歲，均有組織學活檢對照。

1.2 方法

1.2.1 LCT制備 暴露宮頸，用棉簽擦去宮頸血液及分泌物，采用專用采樣刷在宮頸肉眼可疑病變處保持適當壓力同一方向旋轉5～8圈，采集好后取下刷頭放入美國BD公司專用婦科標本保存瓶內，BD公司PrepMate-PrepStain自動制片機制片。對不滿意標本要求重新取樣制片。

1.2.2 細胞塊制備 1)在已完成LCT制片的標本保存瓶里加入蒸餾水10 mL，利用吸管反復沖洗出保存瓶內刷頭上殘余的細胞及小組織碎片，連同LCT制片完成后剩余的細胞一并放入15 mL離心管內，2 000 r/min離心10 min；2)用吸管輕輕吸去離心管內上清液，加入濃度為2.51 mmol/L海藻酸鈉2 mL，于震蕩儀上震蕩10 s，2 000 r/min離心10 min；3)用吸管沿離心管內側壁緩慢滴加濃度為18.02 mmol/L氯化鈣1 mL，靜置10 min；4)離心管底細胞聚集成團被變性的海藻酸鈉包裹在內，外表形似果凍狀，用鑷子夾出，并用剪刀剪去表面多余的介質，隨后置于包埋紙內，行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、鏡檢。

1.2.3 ICC檢測 對LCT診斷的41例可疑腺癌用4 μm厚的細胞塊石蠟切片做ICC染色：一抗p16、p53、WT1、ER、PR、CA125、PAX-8、CK7、CK20、SP-B、TTF-1、NapsinA購自福州邁新生物技術公司，二抗顯色系統(tǒng)購自丹麥Dako公司，采用EnVision二步法，具體操作步驟按照說明書進行，用已知陽性標本作對照，用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判斷

細胞學診斷每張切片均由中、高級病理細胞學醫(yī)師雙人閱片，細胞塊判讀標準與組織學相同。

LCT判讀標準根據2015年第三版Bethesda報告系統(tǒng)診斷報告模式[5]：1)未見腺上皮病變；2)腺上皮細胞異常：(1)非典型性腺細胞，無特殊指定，傾向反應性(atypical glandular cells, not otherwise specified， AGC-NOS)：來源于子宮頸管腺細胞、子宮內膜腺細胞；(2)非典型性腺細胞，傾向于瘤變(atypical glandular cells, favor neoplastic，AGC-FN)：來源于子宮頸管腺細胞或無法分類；(3)子宮頸管原位腺癌(adenocarcinoma in situ,AIS)；(4)腺癌：來源于子宮頸管腺癌、子宮內膜腺癌、子宮外腺癌。

ICC結果判讀: TTF-1、ER、PR、PAX-8、p53、WT1以腫瘤細胞胞核出現棕黃色或深棕色顆粒為陽性， NapsinA、CK7、CK20、SP-B以腫瘤細胞胞漿出現棕黃色或深棕色顆粒為陽性，p16以腫瘤細胞胞漿和胞核出現棕黃色或深棕色顆粒為陽性，CA125以腫瘤細胞胞膜或胞漿出現棕黃色或深棕色顆粒為陽性。根據陽性細胞所占的百分率來判斷：無著色為(-)，陽性細胞率<25%為(+)，25%～75%為(++)，>75%為(+++)。

2 結 果

2.1 302例組織學活檢結果

惡性腫瘤49例(包括宮內膜腺癌31例、宮頸原發(fā)腺癌13例、卵巢漿液性癌4例、肺腺癌1例)，慢性炎癥253例。

2.2 302例細胞學診斷

表1顯示LCT診斷AGC-NOS 213例，AGC-FN 57例，AIS及腺癌32例; 細胞塊診斷腺癌41例(包括宮內膜腺癌26例、宮頸原發(fā)腺癌12例、卵巢漿液性癌2例、肺腺癌1例)，未見腺上皮病變261例。根據診斷總符合率計算公式[6]：(真陽性+真陰性)/總例數，LCT與病理組織學診斷總符合率為86.09%(260/302)，細胞塊與病理組織學診斷總符合率為97.35%(294/302)；根據特異性和敏感性的計算公式[6]，特異性=真陰性/(真陰性+假陽性)，敏感性=真陽性/(真陽性+假陰性)，LCT的特異性和敏感性分別為83.79%(212/253)、97.96%(48/49)；細胞塊的特異性和敏感性分別為100%(253/253)、83.67%(41/49)。

表1 宮頸腺上皮病變細胞學診斷與組織學診斷對照

2.3 LCT和細胞塊顯微鏡下特點及ICC結果

宮頸正常腺上皮在LCT中呈柵欄狀或散在分布，可見小核仁，在細胞塊中呈腺樣排列，且柱狀上皮細胞核位于基底部。腺癌在LCT中多呈三維立體結構或單個散在，在細胞塊中呈腺樣排列，具體特點及ICC結果見表2和圖1。

表2 LCT、細胞塊顯微鏡下特點及ICC結果

圖1 腺癌在LCT和CB中的形態(tài)特點及ICC結果

3 討 論

子宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，是威脅亞洲婦女健康的第二大惡性腫瘤[7]。LCT是子宮頸癌及癌前病變的初篩法，存在一定的假陰性和假陽性[8]。近年來，細胞塊應用于宮頸LCT的文獻報道[8-11]多是在鱗狀上皮病變內的研究。由于腺上皮受炎癥、修復、化生、放化療等因素影響易發(fā)生反應性改變，這一類良性反應性病變僅通過LCT很難與腫瘤性病變區(qū)分開，本文研究中LCT診斷與組織學診斷的總符合率為86.09%，其中LCT診斷的212例AGC-NOS、39例AGC-FN和2例AIS，組織學最終確診為良性反應性改變。余小蒙[12]也認為在宮頸脫落細胞學診斷中包括子宮下段的取樣、輸卵管型上皮化生、修復、宮內節(jié)育器、子宮頸管息肉、微小腺體增殖、Aria-Stella反應和電離放射效應等其細胞形態(tài)特征可能貌似子宮頸腺上皮腫瘤，造成鑒別困難。

LCT不易辨別宮頸腺上皮良性反應性改變與腺上皮腫瘤，并且不能確定腺癌細胞的來源，我們將LCT制片完成后取樣瓶內剩余液體標本離心收集細胞并通過海藻酸鈉遇氯化鈣迅速變性形成凝膠包裹住細胞的原理制備成細胞塊。該方法操作簡單，無需加熱及反復多次離心，目前尚未見相關文獻報道，對于宮頸LCT微量標本，通過該方法細胞數量得到最大程度收集且細胞形態(tài)保存較好。通過對本文302例細胞塊切片閱片觀察發(fā)現其結構清晰,背景干凈，無血液、黏液、炎癥細胞等干擾，細胞塊中腺上皮細胞保留了接近于組織學的形態(tài)，并且通過離心高度濃縮恢復了一定的組織學結構特點，特別是腺癌細胞在細胞塊中出現形似組織學的腺體結構，更容易被識別。本文研究中細胞塊的敏感性為83.67%低于LCT的97.96%，但細胞塊的特異性為100%高于LCT的83.79%，并且細胞塊與組織學診斷的總符合率為97.35%高于LCT與組織學診斷的總符合率86.09%。與LCT對比，從細胞塊鏡下形態(tài)很容易識別出腺上皮受炎癥、修復、化生、放化療等因素影響導致的良性反應性改變，可對LCT診斷的非典型性腺細胞(atypical glandular cells，AGC)病例分流，避免不必要的宮頸活檢術；另外，對于腺癌可用細胞塊切片做ICC檢測明確腺癌的來源，并且細胞塊也為不耐受手術的晚期腫瘤患者的后續(xù)基因檢測提供了條件。藍旭麗[9]認為鑒于陰道鏡活檢取材的局限性，細胞塊有明顯優(yōu)勢，它可以把臨床采集的幾乎所有的細胞收集起來通過連續(xù)切片可能會看到陰道鏡活檢陰性的病變。本文研究中細胞塊漏檢8例(宮內膜腺癌5例，宮頸原發(fā)腺癌1例，卵巢漿液性癌2例)，其中3例宮內膜腺癌和2例卵巢漿液性癌通過細胞塊連續(xù)切片并未查見腫瘤細胞，我們分析是由于卵巢和宮內膜癌從原發(fā)灶脫落并移到子宮頸口或陰道的腫瘤細胞數量較少，LCT制片完成后用于制備細胞塊的剩余標本僅含有極其稀少的腫瘤細胞或者已無腫瘤細胞；另外2例宮內膜腺癌和1例宮頸原發(fā)腺癌通過連續(xù)切片后查見腺癌細胞。我們建議在制備細胞塊時盡可能最大量的收集細胞成分，比如反復沖洗涮出保存瓶內刷頭上殘余的細胞及小組織碎片，另外需要注意在細胞塊修片時少修并且連續(xù)切片8張以上以提高細胞塊中的陽性發(fā)現。

宮頸脫落細胞學診斷腺癌時，我們在考慮宮頸原發(fā)病變的同時，也要考慮到有子宮內膜、卵巢和輸卵管等鄰近生殖器官惡性腫瘤脫落或累及的可能。文獻報道[13]約30%的內膜癌、7%的卵巢癌患者的宮頸涂片中可以發(fā)現癌細胞，內膜癌比卵巢癌容易更早期出現于宮頸涂片中。內膜、卵巢等生殖道來源的癌細胞脫落或累及至宮頸時可以與原發(fā)宮頸癌的癥狀相似,臨床癥狀上均表現為不規(guī)則陰道出血或排液，患者常規(guī)進行宮頸脫落細胞學檢查，可以及早地發(fā)現內膜、卵巢等部位的腫瘤性病變。腺癌細胞從原發(fā)灶脫落又移到子宮頸口或陰道，惡性細胞常常退變明顯，細胞清晰度不佳且細胞量較少，LCT通常表現為無特異性的三維立體或巢團狀結構，而細胞塊中可以查見更易辨識的典型形態(tài)學特征：如宮內膜樣腺癌中由復層腺上皮圍成的腺腔結構、卵巢漿液性癌的砂粒體結構等，在細胞塊形態(tài)學基礎上加做相關ICC檢測就能進一步明確腺癌來源。另外，宮頸脫落細胞學查見腺癌細胞，除了生殖道來源外，還需要考慮到少見的子宮外腫瘤的轉移。本文研究中確診肺腺癌宮頸轉移1例，肺腺癌宮頸轉移國內外文獻報道罕見，經過檢索截止目前僅有6例[14-19]，本例既往有肺癌病史，且細胞塊切片中的平鋪狀腺樣結構不同于內膜及頸管腺癌，結合TTF-1(+)、NapsinA(+)、CK7(+)、SP-B(+)、CK20(-)支持肺腺癌宮頸轉移的診斷。鑒別宮頸腺癌是原發(fā)還是子宮外遠隔部位的轉移十分重要，臨床上宮頸的早期原發(fā)腺癌首選手術治療、中晚期輔以放射治療[20]，而子宮外腫瘤轉移至宮頸，臨床分期晚，治療主要以針對原發(fā)灶的治療為主。

綜上所述，宮頸脫落細胞的細胞塊制備操作簡便、經濟，細胞塊具有形似組織學結構的特征并可在其基礎上做ICC及基因檢測，我們建議在宮頸細胞學篩查時，對LCT診斷腺上皮細胞異常病例可以常規(guī)制備細胞塊進行聯合檢測。

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