龐皓玥，胡凱文，孫滿強，周天

100029 北京，北京中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院(龐皓玥、孫滿強)；100078 北京，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 腫瘤科(胡凱文、周天)

腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥致死的主要原因，如何有效抗轉(zhuǎn)移仍是臨床腫瘤治療難以攻克的關(guān)鍵問題。有研究發(fā)現(xiàn)，代謝模式變化在腫瘤轉(zhuǎn)移中必不可少[1]。癌細胞在有氧狀態(tài)下，糖酵解途徑供能增強，而有氧磷酸化供能比例下降，這種代謝模式可以通過保證缺氧條件下的供能、提供大量合成原料、形成酸性微環(huán)境抑制免疫等途徑[2]，為癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。線粒體損傷是腫瘤代謝模式變化的基礎(chǔ)，如線粒體內(nèi)酶表達異常、膜通透性改變、ROS生成異常等，均有助于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[3]。因此，從能量代謝與線粒體損傷角度進行研究，對抑制腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力具有重要意義。

長期以來，中醫(yī)活血化瘀法被廣泛應(yīng)用于晚期癌癥患者的臨床治療中。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是經(jīng)典活血化瘀藥川芎的主要成分，具有抑制多種腫瘤細胞增殖的藥理作用。順鉑(Cisplatin,DDP)是傳統(tǒng)化療藥物，經(jīng)研究證實，TMP與DDP的聯(lián)合，可以增強對非小細胞肺癌的抑制作用[4-6]。本課題組前期研究表明，TMP聯(lián)合DDP可以調(diào)控Twist表達，從而抑制細胞增殖[7]，而PI3K/AKT/mTOR通路為Twist上游，是細胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子。因此，本研究從能量代謝角度，探討TMP聯(lián)合DDP的抗腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑

人肺腺癌A549細胞株購于上海蓋寧生物科技有限公司。TMP標準品購自上海源葉生物科技有限公司(貨號:B20203);DDP標準品購自上海源葉生物科技有限公司(貨號:B24462);JC-1試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)有限公司(貨號:KGA602)。一抗：GAPDH monoclonal antibody、mTOR polyclonal Rabbit antibody、Phospho-mTOR(Ser2448) Rabbit Antibody、PI3K p85 Monoclonal antibody、AKT Monoclonal antibody購于Proteintech公司(貨號:60004-1-Ig、20657-1-AP、AF3308、60225-1-Ig、60203-2-Ig);二抗：Goat Anti-Rabbit IgG H+L、Goat Anti-Mouse IgG H+L購于中杉金橋公司(貨號:ZB-2301、ZB-2305)

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

人肺腺癌A549細胞采用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM(高糖)培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察其生長情況，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將細胞分為空白對照組、DDP組、DDP聯(lián)合高、中、低劑量TMP組(DDP+TMP)。根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果確定TMP高、中、低劑量藥物濃度，DDP藥物濃度通過查找相關(guān)文獻確定為2 μg/mL[8]，藥物處理時間24 h。

1.3 CCK-8法測定TMP對人肺腺癌A549細胞增殖的影響

以人肺腺癌A549細胞為測試細胞株，選用對數(shù)生長期的貼壁腫瘤細胞，用胰酶消化后，以含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至5×104個/mL，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h后細胞貼壁。各實驗組孔分別加入16 mM、8 mM、4 mM、2 mM、1 mM、0.5 mM梯度濃度的TMP標準品，對照組不加入藥物，每組設(shè)置6個復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后進行增殖能力檢測。檢測時每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱中1 h。采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔OD值，計算各組抑制率。細胞增殖抑制率=[(對照組平均OD值-實驗組平均OD值)/(對照組平均OD值-空白組平均OD值)]×100%。根據(jù)實驗結(jié)果確定DDP+TMP高、中、低劑量組TMP的藥物濃度。

1.4 TMP聯(lián)合DDP對肺癌A549細胞形態(tài)的影響

取對數(shù)生長期的肺癌A549細胞，以5×105個/mL細胞/孔的密度接種于6孔板中，待細胞貼壁生長融合至75%以上時，按照分組加入DDP及不同濃度TMP處理細胞。將干預(yù)后的細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下(放大倍數(shù)為200倍)觀察細胞形態(tài)的變化并拍照。

1.5 Transwell小室實驗測定腫瘤細胞侵襲能力

在Transwell小室上室面加入100 μL用DMEM培養(yǎng)基稀釋的Matrigel(體積稀釋比例為1∶8)，下室面用移液槍頭涂抹Fibronectin(濃度0.5 mg/mL)，置于37℃培養(yǎng)箱中包被2 h，使Matrigel凝固成膠，4℃過夜風干。取對數(shù)生長期的A549細胞，加入DDP及TMP處理細胞，用藥干預(yù)24 h。接種細胞前拿出小室，吸出小室中殘余液體，每小室加入100 μL DMEM，37℃孵育30 min，水化基底膜。收集各組細胞，重懸于不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL細胞。將各組細胞接種于Transwell小室的上室中，接種體積為200 μL(1×104個細胞)，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS洗2次，加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min，PBS洗2次，用棉簽擦拭小室上室面未穿過小室膜的細胞，用結(jié)晶紫染色15 min后，在倒置顯微鏡(放大倍數(shù)為200倍)下觀察穿膜細胞數(shù)。實驗獨立重復(fù)2次。

1.6 透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)

取各組細胞消化，離心，制備成1×106個/mL細胞，棄上清，留下層細胞，加入3%戊二醛固定液固定2 h， 1%鋨酸固定1 h，逐級乙醇、丙酮脫水后, 環(huán)氧樹脂包埋, 超薄切片，經(jīng)鈾、鉛雙重染色后，1200EX透射電鏡觀測各組細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。

1.7 JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測線粒體膜電位

收集DDP及TMP干預(yù)后各組細胞量為1×106個/管, 用 PBS 洗滌細胞2次(離心2 000 r/min，5 min)，取100 μL 10× Incubation Buffer加900 μL滅菌去離子水稀釋成1×Incubation Buffer，混勻并預(yù)熱至37℃，吸取500 μL加入1 μL JC-10，渦旋混勻配成JC-10工作液，取500 μL JC-10工作液將細胞均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15～20 min；室溫離心(2 000 r/min，5min)收集細胞，用1×Incubation Buffer洗兩次；吸取500 μL 1×Incubation Buffer重新懸浮細胞；用流式細胞儀檢測(Ex=488 nm;Em=530 nm)線粒體膜電位，設(shè)未經(jīng)處理的正常細胞為陰性對照組和陽性對照組，根椐陰性和陽性對照組的雙參數(shù)散點圖來設(shè)定門的位置。實驗獨立重復(fù)2次。

1.8 Western blot 檢測 PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR的表達

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的A549細胞，調(diào)整細胞密度為5×105個/mL細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁生長融合至75%以上時，加入DDP及相應(yīng)濃度的TMP干預(yù)細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。各組細胞加入細胞裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，用細胞刮刀刮下，收集至離心管，冰上裂解25 min后，12 000 r/min，4℃，離心10 min，取上清液為蛋白樣品，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液，置于100℃水浴中變性5 min。SDS-PAGE分離蛋白，根據(jù)目的蛋白的相對分子量配制相應(yīng)的分離膠濃度(10%)。加樣后分別進行蛋白電泳、蛋白電轉(zhuǎn)移至PVE膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1.5 h。將封閉后的膜按照目標蛋白所處位置進行剪切，分別加入對應(yīng)的一抗PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)，4℃反應(yīng)過夜。TBST洗膜3次，5min/次；根據(jù)一抗的種屬選擇相應(yīng)的二抗(Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG，稀釋比例為1∶10 000)37℃孵育2 h。最后ECL發(fā)光、顯影、拍照。相對蛋白含量用各蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶的灰度值來表示。實驗獨立重復(fù)2次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

運用軟件SPSS 17.0 進行分析統(tǒng)計，計量資料采用均數(shù)±標準差表示。多組均數(shù)比較采用單因素分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TMP對人肺癌A549細胞增殖的影響，確定給藥濃度

CCK-8結(jié)果顯示，運用梯度濃度TMP干預(yù)肺癌A549細胞后，細胞增殖抑制率呈劑量依賴性，隨著TMP濃度升高，其增殖抑制率也增高。與對照組相比，TMP對A549肺癌細胞的抑制差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。取TMP干預(yù)肺癌A549細胞的近半數(shù)抑制濃度，確認TMP高、中、低給藥劑量分別為2 mM、1 mM、0.5 mM(表1)。

表1 CCK-8測定TMP對肺癌A549細胞增殖的抑制作用(N=6)

2.2 TMP+DDP對A549肺癌細胞形態(tài)的影響

各組細胞生長狀況良好，細胞呈細長梭形，細胞間排列緊密形成集落。實驗組細胞隨藥物濃度的增高數(shù)量減少，形態(tài)改變；其中DDP+TMP(2 mM)組、DDP+TMP(1 mM)組、DDP+TMP(0.5 mM)組細胞由具有較高侵襲能力的細長梭形變?yōu)榍忠u能力較弱的圓形，細胞體積縮小，部分可見細胞核固縮，胞漿內(nèi)可見顆粒和碎片，細胞生長明顯受到抑制(圖1)。

圖1 不同濃度TMP+DDP對于A549細胞形態(tài)的影響(×200)

2.3 TMP+DDP對A549細胞侵襲能力的影響

Transwell小室法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，各實驗組細胞均可使穿過鋪有人工基質(zhì) Matrigel 濾膜的細胞數(shù)量明顯降低，DDP+TMP(2mM)組細胞穿膜數(shù)量最低。隨著 TMP 濃度的增高，細胞侵襲數(shù)逐漸減少，侵襲抑制作用逐漸增強，且穿膜面細胞形態(tài)趨于圓形(圖2)。

圖2 不同濃度TMP+DDP對于A549細胞侵襲能力的影響(×200)

2.4 TMP+DDP對A549細胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響

運用透射電鏡觀察各組癌細胞線粒體結(jié)構(gòu)可見，與對照組相比，應(yīng)用 DDP 使細胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡壞死，線粒體多呈圓形，雙層膜結(jié)構(gòu)模糊，線粒體嵴數(shù)量較少，排列紊亂，肌節(jié)斷裂；聯(lián)合應(yīng)用TMP后，細胞內(nèi)線粒體形狀趨于橢圓形，且隨TMP劑量增高，線粒體形態(tài)更加飽滿，線粒體嵴數(shù)量較多，排列較清晰(圖3)。

圖3 電鏡觀察不同濃度TMP+DDP干預(yù)A549細胞線粒體結(jié)構(gòu)(×30 000)

2.5 TMP+DDP對A549細胞線粒體膜電位的影響

JC-1法檢測線粒體膜電位顯示，與對照組相比，各組線粒體膜電位均顯著降低(P<0.05)，但DDP+TMP組線粒體膜電位較DDP組升高，且隨TMP濃度升高，線粒體膜電位有升高的趨勢，DDP+TMP(2mM)組較DDP組線粒體膜電位升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05(圖4)。

圖4 不同濃度TMP+DDP干預(yù)A549細胞線粒體膜電位變化(JC-1)

2.6 TMP+DDP對A549細胞 PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達的影響

Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR通路蛋白,結(jié)果顯示(圖5)，與對照組相比，DDP組及DDP+TMP組均可下調(diào)PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達(P<0.05)。DDP+TMP組在降低各蛋白表達方面優(yōu)于單獨應(yīng)用DDP組，且隨TMP濃度升高，各蛋白表達量呈現(xiàn)降低的趨勢。與DDP組相比，DDP+TMP(2mM)組可明顯下調(diào)PI3K、mTOR和p-mTOR蛋白表達(P<0.05)，DDP+TMP(1mM)組可下調(diào)mTOR、p-mTOR蛋白表達(P<0.05)。

圖5 DDP+TMP對A549細胞內(nèi)PI3K/AKT/mTOR信號通路表達的影響

3 討 論

近年來，有關(guān)癌細胞能量代謝特征的研究受到越來越多重視，能量代謝重構(gòu)被認為參與了癌癥的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移過程。早在1920s，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞能量代謝的糖酵解途徑異常活躍，并認為其與線粒體損傷有關(guān)[9]。腫瘤細胞極活躍的代謝活動，造成周圍環(huán)境的乏氧狀態(tài)，而癌細胞線粒體功能受損，促進了糖酵解途徑供能，保證了腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的能量需求[10]。線粒體功能受損還與腫瘤細胞抵抗凋亡、逃避免疫監(jiān)督等有助于腫瘤轉(zhuǎn)移的特性密切相關(guān)[11]。這使靶向線粒體的治療手段成為近年來腫瘤治療領(lǐng)域的熱點。

中醫(yī)對癌癥常伴有血瘀狀態(tài)的認知，與腫瘤周圍低氧、酸性微環(huán)境的形成十分相似。研究表明，活血化瘀中藥可以通過抑制血管生成，改善乏氧微環(huán)境等機制，發(fā)揮抗腫瘤作用[12]。而癌細胞有氧糖酵解的能量代謝異常，增強了其對周圍環(huán)境的適應(yīng)性。因此，我們推測中醫(yī)活血化瘀藥改善乏氧微環(huán)境狀態(tài)，從根本上改變了線粒體損傷的環(huán)境壓力，從而使線粒體有氧代謝的功能恢復(fù)，抑制糖酵解的發(fā)生，最終控制腫瘤生長轉(zhuǎn)移。研究顯示，活血化瘀中藥改善缺氧環(huán)境作用與PI3K/AKT/mTOR信號通路密切相關(guān)[13]。其中，AKT磷酸化后可降低線粒體ATP的消耗，使組織維持較低的線粒體膜電位，進而減少鈣離子進入線粒體和再灌注初期活性氧的生成[14]。因此，PI3K/AKT/mTOR通路很可能是活血化瘀中藥調(diào)節(jié)線粒體功能發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵機制。目前該研究思路還鮮有報道，值得深入挖掘。

TMP是傳統(tǒng)中醫(yī)活血藥川芎、當歸的主要成分，可以通過改善血液高凝狀態(tài)、抗腫瘤血管生成，改善乏氧微環(huán)境等方面抑制腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移[15]。DDP是治療非小細胞肺癌常用的化療藥物，其通過阻礙腫瘤細胞DNA復(fù)制，從而抑制細胞的有絲分裂，雖然抗腫瘤效果明顯但毒性較強。TMP與DDP聯(lián)合使用，不僅能增強抗腫瘤效果，還能降低化療藥物引起的毒副作用，多項研究支持TMP聯(lián)合DDP在肺癌治療領(lǐng)域良好的應(yīng)用前景[16-17]。本研究擬從改善腫瘤代謝角度，闡述DDP聯(lián)合TMP抑制肺癌細胞過程中TMP發(fā)揮的作用。

本研究首先通過CCK-8法確定TMP的用藥濃度，再觀察TMP聯(lián)合DDP對腫瘤細胞生長侵襲能力的影響。經(jīng)TMP及DDP干預(yù)24 h后，顯微鏡下觀察肺癌A549細胞體積縮小，變?yōu)閳A形，部分細胞內(nèi)可見顆粒和碎片，細胞增殖速度減慢，與對照組形成較大差異。Transwell小室侵襲實驗顯示，各實驗組細胞穿膜數(shù)量均少于對照組(P<0.05)，且TMP聯(lián)合DDP對細胞穿膜的抑制明顯增強。以上結(jié)果說明TMP聯(lián)合DDP可以抑制A549細胞的生長及侵襲，且隨TMP劑量升高效用更加明顯。因此可以推測，TMP聯(lián)合DDP增強了對A549細胞增殖及侵襲能力的抑制作用，較單獨應(yīng)用DDP效果更佳，且表現(xiàn)出劑量依賴性。

線粒體功能正常有賴于其結(jié)構(gòu)的完整，已有的研究顯示，腫瘤細胞的線粒體普遍存在DNA突變，拷貝數(shù)變化、線粒體膜穩(wěn)定性以及線粒體結(jié)構(gòu)動態(tài)改變等結(jié)構(gòu)異常，而線粒體功能隨之發(fā)生紊亂，并與實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。如線粒體膜電位發(fā)生改變，增加抗凋亡蛋白的表達，延長腫瘤細胞壽命，減少轉(zhuǎn)移侵襲過程中的損耗[19]。本研究通過透射電鏡觀察各組細胞線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，單獨使用DDP后細胞主要發(fā)生空泡壞死，線粒體受損，表現(xiàn)為嵴數(shù)量較少且排列紊亂；聯(lián)合應(yīng)用TMP后，線粒體形態(tài)更為飽滿，且形狀趨于橢圓形，可見排列清晰的嵴。這提示TMP可以降低線粒體損傷程度，使其發(fā)揮正常功能。同時，本研究還對線粒體膜電位進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，DDP及DDP+TMP組線粒體膜電位均顯著下降(P<0.05)，但聯(lián)合應(yīng)用TMP使線粒體膜電位較單獨應(yīng)用DDP有所升高，且隨TMP濃度升高，線粒體膜電位有升高的趨勢，其中，高劑量組線粒體膜電位升高較為明顯(P<0.05)。因此，我們推測TMP可以促進線粒體的正常功能，從而影響腫瘤細胞代謝。

PI3K/AKT通路是調(diào)控細胞能量代謝的經(jīng)典通路，研究表明，其可以通過調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α表達，從而調(diào)控癌細胞的能量代謝模式，增加癌細胞對周圍乏氧環(huán)境的適應(yīng)性[20]。mTOR是PI3K/AKT下游的關(guān)鍵激酶， PI3K/AKT/mTOR通路可以上調(diào)癌細胞糖酵解相關(guān)酶的活性，加強糖酵解過程[21]。另有一項三陰性乳腺癌細胞的研究顯示，AKT的激活可以調(diào)節(jié)癌細胞的線粒體代謝和氧化磷酸化[22]。本研究利用Western blot檢測肺癌A549細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的蛋白表達發(fā)現(xiàn)，TMP聯(lián)合DDP可使肺癌A549細胞內(nèi)PI3K、AKT及mTOR蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，TMP聯(lián)合DDP組對PI3K/AKT/mTOR通路的抑制作用要優(yōu)于單獨應(yīng)用DDP組，且呈濃度依賴性。同時，mTOR磷酸化修飾(p-mTOR)減少，即mTOR蛋白活性也受到了影響。這提示TMP聯(lián)合DDP增強了對PI3K/AKT/mTOR信號通路的抑制作用，與肺癌A549細胞的線粒體功能及能量代謝改變相關(guān)。

綜上所述，TMP聯(lián)合DDP能抑制腫瘤細胞增殖及侵襲能力，其機制可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路，改善線粒體功能，進而使癌細胞能量代謝模式發(fā)生改變，發(fā)揮聯(lián)合抗腫瘤作用。

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