曲 靜 楊亞軍 陳祖學(xué)

魚腥草提取物對大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練小鼠免疫功能及炎癥的影響*

曲 靜 楊亞軍 陳祖學(xué)

（興義民族師范學(xué)院 體育學(xué)院，貴州 興義 562400）

【目的】探討魚腥草提取液對大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練小鼠的免疫功能及炎癥的影響?！痉椒ā?周齡健康雄性C57BL/6J小鼠32只，隨機(jī)分為對照組（C）、運(yùn)動組（E）、魚腥草組（H）、運(yùn)動+魚腥草組（E+H）。E、E+H組完成6周遞增負(fù)荷的大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練；H、E+H組于訓(xùn)練前以120mg/kg體重灌胃魚腥草提取液。每周稱小鼠體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測WBC計數(shù)及其分類；ELISA檢測L-CRP和M-CRP水平及血清IFN-γ，IL-4水平；脾稱重，計算脾指數(shù)?！窘Y(jié)果】大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練顯著降低小鼠免疫功能，表現(xiàn)為：與C組相比，E組小鼠體重、脾重量及脾指數(shù)降低，WBC計數(shù)及中性粒細(xì)胞百分比增加，淋巴細(xì)胞百分比降低（＜0.05或＜0.01），且L-CRP和M-CRP水平、血清IL-4水平升高及INF-γ水平、IFN-γ/IL-4降低（＜0.05或＜0.01）。而補(bǔ)充魚腥草提取液可部分逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)的變化，表現(xiàn)為：與E組相比，E+H組小鼠WBC計數(shù)降低，淋巴細(xì)胞百分比增加；L-CRP和M-CRP水平、血清IL-4水平降低，血清INF-γ水平及IFN-γ/IL-4的升高（＜0.05或＜0.01）。【結(jié)論】魚腥草提取液可逆轉(zhuǎn)大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練導(dǎo)致的免疫功能下降，可能與增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫，改善Th1/Th2失衡狀態(tài)，緩解肝臟及骨骼肌炎癥狀態(tài)有關(guān)。

魚腥草提取液；大強(qiáng)度；免疫細(xì)胞；炎癥因子

大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練可降低機(jī)體免疫機(jī)能，加劇炎癥狀態(tài)，降低運(yùn)動能力。魚腥草為傳統(tǒng)的入藥食用皆可的植物，隨著對魚腥草的化學(xué)成分、藥理成分的深入研究，其多種生物活性物質(zhì)，在炎癥[1,2]抗過敏[3]、抗病毒[4, 5]、抗氧化[6, 7]、抗癌[8]等多個方面發(fā)揮重要作用。有報道稱魚腥草及其提取物可影響運(yùn)動干預(yù)模型小鼠的機(jī)能狀態(tài)，例魚腥草黃酮能夠明顯增加疲勞模型小鼠的糖原儲備、乳酸清除能力，促進(jìn)抗疲勞能力的提高[9, 10]。而外源補(bǔ)充魚腥草素也有降低力竭運(yùn)動模型大鼠的血清丙二醛，提高超氧化物歧化酶，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)的作用[11]。然而魚腥草及其有效成分對大強(qiáng)度訓(xùn)練導(dǎo)致的免疫功能降低及炎癥狀態(tài)的影響尚未闡釋清楚，本研究通過對免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫平衡重要標(biāo)志性炎癥因子的檢測和評價，探討魚腥草提取液的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 對象及分組

6周齡C57BL/6J小鼠32只（雄性，weight：19.81±0.76g），購于貴州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心（許可證證號：SCXK（黔）2012-0001）。隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為安靜對照組（control，C組）、魚腥草組（houttuynia cordata，H組）、運(yùn)動組（exercise，E組）、運(yùn)動+魚腥草組（exercise + houttuynia cordata，E+H組）；所有小鼠喂食普通飼料（101007，購于江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程），飼養(yǎng)室溫為23±1℃，相對濕度為55%-70%，晝夜節(jié)律為12h。小鼠均自由飲食飲水。

1.2 研究方法

1.2.1 訓(xùn)練方案

C組和H組無訓(xùn)練安排。三天的適應(yīng)性訓(xùn)練后，E組、E+H組完成6周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練：6天/周，每天安排2次訓(xùn)練（上、下午各1次），第1周每次訓(xùn)練25min，訓(xùn)練時間每周每次遞增5min至第四周達(dá)到每次訓(xùn)練40min，于第5周每次訓(xùn)練50min，第6周每次訓(xùn)練60min。

1.2.2魚腥草提取液及小鼠灌胃方案

將干魚腥草粉碎成粉末后，按照50g粉末逐次加入總量為1L ddH2O，小火加熱濃縮至50ml魚腥草提取液（終濃度1g/ml），于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?H、E+H組小鼠于每天訓(xùn)練半小時前以120mg/kg體重灌胃服用魚腥草提取液。

1.2.3 檢測指標(biāo)

6周實(shí)驗(yàn)干預(yù)期間，每周稱取小鼠體重。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的12小時后，按照3ul/g體重腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，于下腔靜脈采血。EDTA抗凝血，利用全自動血液分析儀檢測白細(xì)胞計數(shù)（white blood cell，WBC）、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比；非抗凝血離心（3000rpm，20min）后收集血清用；采血后，收集小鼠部分組織，如肝臟、腓腸肌及脾臟，計算脾指數(shù)=脾重量*100/體重。

1.2.4 血清炎癥因子檢測

小鼠血清γ干擾素（interferon γ，IFN-γ），白介素4（interleukin-4，IL-4）水平以及肝臟、股四頭肌組織勻漿液中C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平均采用ELISA方法（R&D Systems，USA）檢測，按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS21.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean ± SD）表示。各組小鼠體重，采用重復(fù)測量方差分析；其它數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析，LSD事后檢驗(yàn)比較組間差異，以＜0.05代表組間的顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 魚腥草提取液對大強(qiáng)度訓(xùn)練小鼠體重的影響

表1 魚腥草提取液對大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練小鼠體重的影響

注：*<0.05，**<0.01，與C組比；#<0.05，##<0.01，與E組比；@<0.05，@@<0.01，與H組比。

如表1所示，與C組相比，自實(shí)驗(yàn)干預(yù)的第4周起，E組、E+H組小鼠體重顯著下降（＜0.05或＜0.01）；但與E組相比，H組小鼠體重顯著增加（＜0.05），但E+H組小鼠體重未改變（＞0.05）；與H組相比，補(bǔ)充魚腥草提取液的E+H組小鼠在實(shí)驗(yàn)干預(yù)的3-6周均也呈現(xiàn)顯著的下降。

表2 魚腥草提取液對大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練小鼠脾重量及脾指數(shù)的影響

注：*<0.05，**<0.01，與C組比；#<0.05，##<0.01，與E組比；@<0.05，@@<0.01，與H組比。

2.2 魚腥草提取液對大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練小鼠脾重量及脾指數(shù)的影響

由表2可知，與C組相比，E、E+H組脾重量、體重以及脾指數(shù)明顯降低（＜0.05或＜0.01）；與E組相比，H組小鼠脾重量、體重及脾指數(shù)顯著提高（＜0.05或＜0.01），E+H組的各個指標(biāo)均無組間差異（＞0.05）；與H組相比，E+H組脾重量、體重以及脾指數(shù)也具有明顯的降低（＜0.05）。

2.3 魚腥草提取液對大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練小鼠免疫細(xì)胞的影響

由表3可知，與C組相比，E、E+H組小鼠淋巴細(xì)胞百分比顯著降低，中性粒細(xì)胞百分比顯著升高（<0.05），E組小鼠同時伴有WBC計數(shù)顯著增加（<0.05），但E+H組小鼠各指標(biāo)改變幅度低于E組。與E組相比， H組的WBC計數(shù)減少，同時淋巴細(xì)胞百分比提高，中性粒細(xì)胞百分比降低，有顯著性差異（<0.05），且E+H組也有相似的改變；與H組相比，E+H組僅發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞百分比的顯著增加（<0.05）。

表3 魚腥草對大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練小鼠白細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比的影響

注：*<0.05，**<0.01，與C組比；#<0.05，##<0.01，與E組比；@<0.05，@@<0.01，與H組比。

2.4 魚腥草提取液對大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練小鼠炎癥因子的影響

與C組相比，E組肌肉及肝臟組織勻漿液中CRP水平及血清IL-4均顯著升高，但血清INF-γ顯著降低，但H組和E+H組的各指標(biāo)均無顯著差異；與E組相比，H組及E+H組肌肉及肝臟組織勻漿液中CRP水平及血清IL-4均顯著降低，但血清INF-γ顯著升高；與H組相比，肌肉及肝臟組織勻漿液CRP水平顯著降低，血清INF-γ顯著升高。

表4 魚腥草提取液對大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練小鼠炎癥因子的影響

注：M-CRP代表肌肉組織勻漿液；L-CRP代表肝臟組織勻漿液。*<0.05，**<0.01，與C組比；#<0.05，##<0.01，與E組比；@<0.05，@@<0.01，與H組比。

3 討論

機(jī)體主要免疫細(xì)胞WBC及其主要分類--中性粒和淋巴細(xì)胞，發(fā)揮重要的免疫監(jiān)控和免疫維護(hù)作用。而參與細(xì)胞免疫的輔助性T（T helper，Th）淋巴細(xì)胞的主要亞型Th1、Th2通過分泌互相抑制的細(xì)胞因子維持Th1/Th2的動態(tài)平衡，是機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的標(biāo)志。Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ（與機(jī)體病毒感染相關(guān)的Th1 特征因子）通過趨化單核細(xì)胞的吞噬作用，增加殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)對細(xì)胞內(nèi)病原體的抵抗。而Th2 細(xì)胞分泌的特征細(xì)胞因子IL-4，通過促進(jìn)炎癥抑制因子（如IL-10等）的釋放，增強(qiáng)體液免疫。多種免疫細(xì)胞、免疫細(xì)胞因子發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用，參與機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。

大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練導(dǎo)致的免疫功能下降過程常伴有多種免疫學(xué)指標(biāo)的異常。已有研究證實(shí)，大強(qiáng)度訓(xùn)練導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能降低時伴隨明顯的Th1/Th2失衡，主要表現(xiàn)為Th1/Th2的特異性細(xì)胞因子，IFN-γ/IL-4的降低[12]。本研究中， 6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練后，運(yùn)動組小鼠不僅表現(xiàn)出體重、脾指數(shù)的顯著降低，同時表現(xiàn)出免疫細(xì)胞，如WBC數(shù)量、中性粒百分比顯著增加，淋巴細(xì)胞百分比顯著降低，且同時表現(xiàn)出，IFN-γ/IL-4顯著降低，反映Th1/Th2失衡并向Th2漂移。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練后，小鼠骨骼肌和肝臟中CRP水平（CRP是目前公認(rèn)的炎癥標(biāo)志物）均增加。以上指標(biāo)共同提示本研究的大強(qiáng)度訓(xùn)練小鼠表現(xiàn)出免疫功能的降低及明顯的組織炎癥浸潤狀態(tài)。

早期利用實(shí)驗(yàn)動物證實(shí)合成魚腥草素或臨床使用的復(fù)方魚腥草膠囊，主要通過提高脾臟、胸腺等免疫器官指數(shù)，提高外周血T淋巴細(xì)胞的比例，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，改善遲發(fā)性超敏反應(yīng)，促進(jìn)抗體生成等方面實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用[13, 14]。有研究提示，魚腥草提取液在Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的作用，與下調(diào)Th2細(xì)胞因子，降低胸腺激活調(diào)節(jié)趨化因子的產(chǎn)生，影響淋巴細(xì)胞遷移，抑制Th2免疫反應(yīng)有關(guān)[15]。對于mRNA水平的研究發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)油、總多糖等魚腥草有效成分通過上調(diào)外周血或脾臟等外周免疫器官的Th1類細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-12的mRNA表達(dá)水平，并下調(diào)Th2類細(xì)胞因子IL-4 mRNA的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)Thl/Th2平衡的重建，改善機(jī)體免疫功能[16]。本研究在確認(rèn)運(yùn)動組小鼠免疫功能降低的情況下，在大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練期間部分運(yùn)動干預(yù)小鼠灌胃補(bǔ)充魚腥草提取液發(fā)現(xiàn)，E+H組小鼠不僅顯著降低小鼠外周血WBC計數(shù)，提高淋巴細(xì)胞百分比，且IFN-γ/IL-4顯著提高。不僅如此，魚腥草的抗炎作用[1,2]在我們的研究中也得到了進(jìn)一步證實(shí)。補(bǔ)充魚腥草提取液可明顯降低骨骼肌和肝臟組織中CRP水平，部分逆轉(zhuǎn)了大強(qiáng)度運(yùn)動導(dǎo)致的小鼠骨骼肌和肝臟組織炎癥浸潤的狀態(tài)。因此，我們推測魚腥草提取液可通過調(diào)節(jié)外周血淋巴細(xì)胞比例，改善Thl/Th2的失衡狀態(tài)，改善外周組織炎癥浸潤狀態(tài)進(jìn)而調(diào)控并改善小鼠免疫功能。

總之，魚腥草提取液可顯著改善大強(qiáng)度游泳運(yùn)動導(dǎo)致的免疫功能低下的狀態(tài)，可能與增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫，改善Th1/Th2失衡狀態(tài)，緩解肝臟及骨骼肌炎癥狀態(tài)有關(guān)。

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Effects of Houttuyniacordata Extract on Immune Function and Inflammation in Mice with High Intensity Swimming Training

QU Jing, etal.

(Xingyi Normal University for Nationalities, Xingyi 562400, Guizhou, China)

貴州省教育廳青年科技人才成長項(xiàng)目（黔教合KY字[2017]366；項(xiàng)目名稱：魚腥草運(yùn)動飲料干預(yù)對大強(qiáng)度訓(xùn)練小鼠運(yùn)動恢復(fù)的影響）、貴州省教育廳青年科技人才成長項(xiàng)目（黔教合KY字[2018] 416；項(xiàng)目名稱：魚腥草天然飲料對大強(qiáng)度訓(xùn)練小鼠免疫機(jī)能的影響）。

曲靜（1985—），副教授，在讀博士，研究方向：運(yùn)動與健康促進(jìn)。