黃倫輝，張嘉懿，李柳栩，張蓓，劉運德，李會強

[1.天津醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院，天津 300203；2．中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院(中國醫(yī)學科學院血液學研究所) 實驗血液學國家重點實驗室， 國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心， 天津 300020；3.天津市兒童醫(yī)院 檢驗科，天津 300074]

特異性IgE(specific IgE, sIgE)抗體在變態(tài)反應性疾病中處于核心地位，其生物功能是通過結(jié)合四聚體高親和力IgE受體而介導的。目前，sIgE的檢測是含量測定而非功能測定[1]，與臨床癥狀相關性不高，因為sIgE水平僅僅表示IgE結(jié)合過敏原的強度，并不能反映結(jié)合過敏原引起的致敏細胞脫顆粒效應。

高親和力IgE受體α鏈(high affinity IgE receptor alpha chain，F(xiàn)cεR1α)在RBL細胞上的表達可用于檢測sIgE與過敏原結(jié)合所導致的組胺、5-羥色胺等炎性介質(zhì)的胞吐[2]。目前，RBL報告系統(tǒng)有RS-ATL8和NFAT-DsRed，用于研究純化的花生過敏原誘導脫顆粒的能力或檢測食物過敏原[3-4]。這2種系統(tǒng)可實現(xiàn)高通量測量，后者也可以與過敏原陣列配合使用[5]，但均不能直接反映脫顆粒效應[6]。

Lang等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)與熒光蛋白融合表達可用于標記神經(jīng)元細胞系PC12中的顆粒。Azouz等[8]的研究證明，NPY-mRFP也可以用來標記非神經(jīng)元RBL細胞中的顆粒，用于定量細胞胞吐。本研究假設穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NPY-增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)和FcεR1α的RBL細胞可以用于人類血清中致敏作用的檢測，通過定量熒光釋放率來評估致敏效應。

1 材料與方法

1.2 方法

1.2.1 基因表達載體的構(gòu)建 通過NCBI網(wǎng)址查詢獲得FcεR1α、NPY-EGFP的基因序列，由義翹神州生物公司合成并構(gòu)建質(zhì)粒pLV-Puro-FcεR1α-T2A-NPY-EGFP-TYK2，對其進行測序鑒定后無內(nèi)毒素大量提取。

1.2.2 脂質(zhì)體Lipo2000轉(zhuǎn)染 取5×105個/孔指數(shù)增長期RBL-2H3細胞過夜培養(yǎng)，第2天換5%血清培養(yǎng)液。對照質(zhì)粒和目的質(zhì)粒各3 μg，分別加入250 μL無血清培養(yǎng)液，取Lipo2000 20 μL加入500 μL無血清培養(yǎng)液，室溫靜置5 min后分別混合。10 min 后逐滴加至細胞，混勻，37 ℃培養(yǎng)6 h，換完全培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 FcεR1α亞基蛋白表達水平的檢測 分別收集一孔轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后的RBL-2H3細胞，用SDS裂解液對細胞進行裂解。采用濕轉(zhuǎn)的方法將等量的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，于4 ℃過夜孵育鼠抗人FcεR1α抗體(1∶2 000)，然后用0.05% Tween-20 TBST洗膜3次(10 min/次)，繼續(xù)室溫孵育二抗羊抗鼠IgE抗體1 h，在1∶5 000的比例下室溫持續(xù)孵育1 h。使用ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)檢測信號。

計數(shù)轉(zhuǎn)染前后細胞各1×105個，以300×g離心10 min。用100 μL FACS緩沖液[2 mmol/L EDTA，0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)，500 mL PBS] 重懸細胞，加入1 μL PE標記的鼠抗人FcεR1α抗體，混合后避光置于4 ℃冰箱30 min。然后清洗去除未結(jié)合的抗體。最后使用BD FACSVerse FCM進行檢測。

1.2.5 β-氨基己糖苷酶介質(zhì)釋放試驗 用1∶10稀釋血清對轉(zhuǎn)染后RBL-2H3細胞于37 ℃孵育1 h進行致敏。過夜培養(yǎng)后，用緩沖液A(140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、0.6 mmol/L MgCl2、1.0 mmol/L CaCl2、5.5 mmol/L葡萄糖、0.1%BSA和10 mmol/L哌嗪-1， 4-二乙磺酸，pH7.4)沖洗細胞2次。在預熱的緩沖液A中將稀釋的BLG(1 μg/mL)或羊抗人IgE抗體添加到細胞中(50 μL/孔)，37 ℃孵育30 min。然后收集上清液，用0.2% Triton X-100裂解細胞。以4-甲基傘形酰-N-乙?；?β-D-葡糖胺(溶于100 mmol/L檸檬酸，pH4.5)為底物，在37 ℃孵育30 min后用0.25 mol/L甘氨酸緩沖液終止反應。在Biotek Synergy2上讀取光密度[D(405 nm)]值，計算β-氨基己糖苷酶釋放率。β-氨基己糖苷酶釋放率=(S-B)/(T-B)×100%，其中B、S、T分別代表培養(yǎng)液、細胞上清液培養(yǎng)液和剩余細胞裂解后培養(yǎng)液的D值。

1.2.6 NPY-EGFP釋放試驗 用Tyrode緩沖液洗滌轉(zhuǎn)染細胞3次。在96孔板，用稀釋血清過夜致敏，用1 μg/mL BLG在37 °C下孵育30 min。將每孔上清液小心地移到新的96孔板，放在冰上，避光。使用熒光板閱讀器在488 nm激發(fā)光和520 nm發(fā)射光下測量熒光信號值。NPY-EGFP釋放率=(S-B)/(T-B)×100%，其中B、S、T分別代表培養(yǎng)液、細胞上清液培養(yǎng)液和剩余細胞裂解后培養(yǎng)液的熒光信號值。

2 結(jié)果

注：CMV，巨細胞病毒(cytomegalovirus)；RRE，Rev反應元件(Rev response element)；cPPT/CTS，中央聚嘌呤序列(central polypurine tract/central)；mPGK，鼠磷酸甘油酸激酶(mouse phosphoglycerate kinase)；Puro，嘌呤霉素(puromycin)；WPRE，土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element)；Amp，氨芐西林(ampicillin)。圖1 表達載體pLV-Puro-FcεR1α-T2A-NPY-EGFP-TYK2結(jié)構(gòu)示意

2.2 轉(zhuǎn)染細胞中FcεR1αmRNA的表達用實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染組和空載組FcεR1αmRNA的相對表達水平,用2-ΔΔCq方法分析數(shù)據(jù)，以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒表達量作為“1”，轉(zhuǎn)染組FcεR1α的表達量是空載組基因表達量的165.905 2倍(圖2)。這提示目的基因高表達于RBL-2H3細胞上。

圖2 實時熒光定量PCR 檢測FcεR1α基因表達水平

2.3 受體蛋白的表達使用抗人 FcεR1α 特異性單克隆抗體檢測空載組和目的組細胞中 FcεR1α的表達。目的組在相對分子質(zhì)量為50 000 處檢測到一條明顯的蛋白條帶，而空載組未能檢測到該條帶(圖3)。

注：1為空載組； 2為目的組。圖3 Western blotting 檢測 FcεR1α 的蛋白表達

使用PE標記的抗人FcεR1α特異性單克隆抗體識別空載組和目的組細胞中FcεR1α的表達情況，目的組陽性細胞率達83.2%。這提示絕大多數(shù)受體表達在細胞膜上。(圖4)

圖4 FACS檢測FcεR1α的細胞定位

2.4 受體蛋白活性試驗使用24例過敏陽性血清和1例過敏陰性血清進行β-氨基己糖苷酶介質(zhì)釋放試驗。過敏陽性血清β-氨基己糖苷酶釋放率為20%～60%，過敏陰性血清在10%以下(圖5)。β-氨基己糖苷酶介質(zhì)釋放試驗證明了人血清sIgE導致了脫顆粒反應，F(xiàn)cεR1α具有結(jié)合血清sIgE的能力。

用相同血清樣本，更換新型指標NPY-EGFP檢測釋放率。過敏陽性血清NPY-EGFP釋放率為20%～80%，與過敏陰性血清可明顯區(qū)分(圖6)，這為接下來的診斷指標研究奠定了物質(zhì)基礎。

注：樣本1～24為過敏陽性血清； 樣本25為過敏陰性血清。圖5 轉(zhuǎn)染后的RBL-2H3細胞β-氨基己糖苷酶介質(zhì)釋放試驗

注：樣本1～24為過敏陽性血清； 樣本25為過敏陰性血清。圖6 轉(zhuǎn)染后的RBL-2H3細胞NPY-EGFP釋放試驗

3 討論

檢測血清sIgE的方法由物理化學法向細胞生物學法過渡是歷史性的進步。細胞生物學法檢測sIgE不僅能反映過敏原結(jié)合sIgE的能力，而且能同步反映過敏原的致敏情況，可進一步研究機體的過敏體征。RBL-2H3細胞系的發(fā)展基于一種FcεR1α的嵌合受體復合物，其中至少需要轉(zhuǎn)染人源的α鏈，與大鼠肥大細胞內(nèi)源性α鏈競爭結(jié)合大鼠內(nèi)源性β、γ鏈[10]。經(jīng)典RBL-2H3細胞系的一個缺點是某些人血清對大鼠細胞具有細胞毒性，需要將血清高度稀釋方可減少此毒性，但這樣做會導致產(chǎn)生不充分的致敏作用，造成假陰性結(jié)果。所以，新一代報告細胞系正在利用敏感報告基因(如熒光素酶或熒光蛋白)替代以前的人源化RBL細胞系，這樣即使使用高達1∶100稀釋度的血清，也可以檢測過敏原sIgE。目前，國外使用2種這樣的人源化RBL報告系統(tǒng)，分別是RS-ATL8和NFAT-DsRed。這2種系統(tǒng)可實現(xiàn)高通量測量，后者也可以與過敏原陣列配合使用。RS-ATL8非常敏感，但有2個主要的缺點：首先，其需要熒光素酶底物，常規(guī)使用相對昂貴；其次，RS-ATL8并不適合用于評估過敏原陣列上的活化，因為熒光素酶檢測需要裂解細胞，這會使熒光信號與過敏原結(jié)合位點的位置出現(xiàn)錯位[4，11]。為了克服這些缺點，一種類似于RS-ATL8的熒光報告系統(tǒng)NFAT-DsRed被開發(fā)出來，通過誘導紅色熒光蛋白表達來報告IgE依賴性活化T細胞核因子核易位[5]。不過，這些報告系統(tǒng)均不能直接反映脫顆粒效應。本研究所構(gòu)建的工具細胞自帶EGFP，省去添加酶底物的繁瑣步驟和額外花費，同時作為預先合成的新型標志物NPY直接反映了過敏反應中的脫顆粒效應，更好地體現(xiàn)了過敏原與高親和受體表面sIgE的結(jié)合，有望實現(xiàn)高通量和高靈敏度檢測。

本研究為開發(fā)一種穩(wěn)定高表達FcεR1α和共表達且便宜的新型指標NPY-EGFP的細胞系奠定了堅實的基礎。從基因水平、蛋白水平、膜蛋白表達水平及功能試驗方面證明了該受體表達的可實現(xiàn)性和優(yōu)越性，以及重要的新型指標NPY-EGFP開發(fā)工作的實現(xiàn)。FcεR1α從基因水平檢測，其表達量特別高，蛋白表達量相對高，但NPY-EGFP熒光強弱不一導致檢測的釋放率不均質(zhì)。事實上，正是由于瞬時表達基因定位的不確定性，才體現(xiàn)出建立穩(wěn)定表達細胞系的重要性。通過后期篩選細胞有望得到高表達FcεR1α且具有均質(zhì)熒光的NPY-EGFP的細胞系。

表達NPY-EGFP的人RBL細胞系的新型報告系統(tǒng)可用于分析與食物蛋白質(zhì)生物學相關的交叉反應性，鑒定過敏原的生物學特性，診斷食物過敏[12]，研究食物蛋白質(zhì)的致敏潛力，比較食品加工前后的變應原性。在對受試者的過敏癥狀進行診斷時，須使用純化的過敏原或過敏原提取物，而基于RBL細胞的免疫測定可提供關于全食物產(chǎn)品引起過敏反應的能力信息[13]，篩選潛在的抗過敏食品化合物或功能表位，然后用于針對食物過敏的免疫治療。