楊昭，曾琳琦，凌葉婷，莫芷晴，何春蘭

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院（廣州 510520）

水產(chǎn)品營養(yǎng)價值高，特征性風(fēng)味突出，由其制備的調(diào)味料可滿足消費者對食品健康和營養(yǎng)的需求，具有廣闊的市場前景[1]。我國擁有豐富的水產(chǎn)品資源，利用水產(chǎn)品制備高品質(zhì)海鮮調(diào)味料是我國調(diào)味品發(fā)展的一個重要趨勢[2]。

廣東省是龜鱉養(yǎng)殖和消費大省。中華草龜（Chinemys reevesiis）、中華花龜（Ocadia sinensis）和鱷龜（Chelydra serpentina）為廣東省重要的大宗養(yǎng)殖龜類品種[3]。中華草龜、中華花龜和鱷龜均含有豐富的蛋白質(zhì)，味道鮮美，一般以鮮食為主，現(xiàn)有研究集中于營養(yǎng)成分分析和生物活性肽制備，未有酶解制備呈味基料的報道[4-5]。堿性蛋白酶有較強的蛋白質(zhì)水解能力，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品調(diào)味料的制備[6-8]。胰蛋白酶具有較強的水解能力，風(fēng)味蛋白酶的酶解液具有較好的感官品質(zhì)。胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成復(fù)合蛋白酶進行酶解，不僅水解效率高，而且可以獲得品質(zhì)較佳的酶解液，已在在水產(chǎn)品酶解液的制備過程中廣泛應(yīng)用[9]。

因此，為探究蛋白酶種類對3種龜肉酶解液品質(zhì)的影響，采用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉進行水解，考察其對酶解液感官品質(zhì)、蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)回收率、肽的分子質(zhì)量分布和抗氧化活性的影響，以期為龜肉資源的深加工和高值化利用提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中華草龜、中華花龜、鱷龜，產(chǎn)自廣東肇慶，均為人工室外養(yǎng)殖，宰殺后取出可食用部位肉，于-18℃凍存；風(fēng)味蛋白酶（酶活 500 LAPU/g）：諾維信中國公司；堿性蛋白酶（酶活20萬 U/g）、胰蛋白酶（酶活 4 000 U/g）：重慶市全新祥盛生物制藥有限公司；卵清蛋白（43 000 Da）、細(xì)胞色素C（12 384 Da）、抑肽酶（6 512 Da）、維生素B12（1 355 Da）、氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

TSK gel G2000 SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm，5 μm，東曹（上海）生物科技有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（配PDA檢測器，日本島津制作所）；K9840凱氏定氮儀（濟南海能儀器股份有限公司）；DKZ-3B電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；3K15臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 龜肉酶解液制備

龜肉堿性蛋白酶酶解液制備：取適量冰凍中華草龜肉，室溫解凍后，用絞肉機將其攪碎成糜狀。準(zhǔn)確稱取40 g肉糜，加入320 g蒸餾水，攪拌均勻后，調(diào)整漿液pH至8.0，加入1%的堿性蛋白酶，迅速攪拌均勻后，在60 ℃水浴搖床中水解3 h。待水解結(jié)束，在沸水浴中煮沸滅酶20 min，冷卻后，在8 000 r/min 4 ℃條件下離心20 min，收集上清液，即為中華草龜肉堿性蛋白酶酶解液，記為ACRH。中華花龜肉和鱷龜肉堿性蛋白酶酶解液制備方法與上述方法相同，分別記為AOSH和ACSH。

龜肉復(fù)合蛋白酶酶解液制備：取適量冰凍中華草龜肉，室溫解凍后，用絞肉機將其攪碎成肉糜狀。準(zhǔn)確稱取40 g肉糜，加入320 g蒸餾水，攪拌均勻后，調(diào)整漿液pH至7.0，加入0.3%的風(fēng)味蛋白酶和0.6%的胰蛋白酶，迅速攪拌均勻后，在55 ℃水浴搖床中水解3 h。待水解結(jié)束，在沸水浴中煮沸滅酶20 min，冷卻后，在8 000 r/min 4 ℃條件下離心20 min，收集上清液，即為中華草龜肉復(fù)合蛋白酶酶解液，記為CCRH。中華花龜肉和鱷龜肉復(fù)合蛋白酶酶解液制備方法與上述方法相同，分別記為COSH和CCSH。

1.2.2 酶解液的感官評價

參照鄧嫣容[10]的方法進行酶解液的感官評價，分別對酶解液的滋味、風(fēng)味和外觀形態(tài)進行打分，感官評價標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。感官評價小組由10名受過感官分析培訓(xùn)的學(xué)生組成（5名男性和5名女性，年齡16-20歲）。感官評價在標(biāo)準(zhǔn)感官評價室進行，選用白光作為光源。

表1 龜肉酶解液感官評價標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 酶解液蛋白質(zhì)含量及回收率[11]

采用凱氏定氮法測定龜肉原料和酶解液中的總氮含量。按式（1）計算蛋白質(zhì)回收率。

1.2.4 酶解液肽的分子質(zhì)量分布

采用高效液相色譜儀對酶解液肽的分子質(zhì)量分布進行檢測[12]。用流動相將2 mL酶解液在10 mL容量瓶中定容，用0.22 μm微孔濾膜過濾后供進樣。標(biāo)準(zhǔn)肽樣品為卵清蛋白（43 000 Da）、細(xì)胞色素C（12 384 Da）、抑肽酶（6 512 Da）和維生素B12（1 355 Da）。檢測波長為220 nm，柱溫箱溫度為30 ℃，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL。流動相為乙腈-超純水-三氟乙酸（體積比為45∶55∶0.1）。

1.2.5 酶解液抗氧化活性分析

酶解液用蒸餾水稀釋3倍后，取2.0 mL稀釋樣品溶液于離心管中，依次加入2.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和2.0 mL 8 mmol/L H2O2溶液，混勻，于37 ℃水浴10 min，再加入2.0 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，混勻，于37 ℃水浴30 min，在510 nm波長處測定吸光度。用蒸餾水做空白對照[13-14]。羥自由基清除率按式（2）計算。

式中：A1為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL FeSO4溶液+2.0 mL H2O2溶液+2.0 mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度；A2為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL FeSO4溶液+2.0 mL無水乙醇+2.0 mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度；A3為2.0 mL蒸餾水+2.0 mL FeSO4溶液+2.0 mL H2O2溶液+2.0 mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測定均進行3次重復(fù)試驗，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類對龜肉酶解液感官的影響

酶解液的感官對其應(yīng)用有重要影響，通常作為呈味基料的酶解液，應(yīng)具備較強的鮮味、無苦味和無異味，具有特征性風(fēng)味。酶解液的滋味特性與蛋白酶的種類、酶解條件（溫度、pH、水解程度和料液比等）、底物（肉的種類、預(yù)處理方式）有關(guān)[15]。由圖1可知，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉酶解液的感官分值有較大影響。6種酶解液感官分值從大到小分別是ACRH、ACSH、COSH、CCSH、CCRH和AOSH。ACRH的感官分值最高，為92.0分，其酶解液呈現(xiàn)澄清、淺黃色、無腥味、強烈鮮味和濃郁肉香味。表明中華草龜肉經(jīng)堿性蛋白酶處理，其酶解液具有較佳的感官分值。AOSH的感官分值最低，為72.5分，其酶解液有較強腥味，且滋味淡，風(fēng)味差，溶液渾濁。經(jīng)堿性蛋白酶處理，酶解液感官分值從大到小的龜肉品種分別是中華草龜（92.0分）、鱷龜（85.8分）和中華花龜（72.5分）。經(jīng)復(fù)合蛋白酶處理，酶解液感官分值從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（84.8分）、鱷龜（83.0分）和中華草龜（77.5分）。

2.2 蛋白酶種類對龜肉酶解液蛋白質(zhì)含量及回收率的影響

蛋白質(zhì)含量是酶解液重要的營養(yǎng)指標(biāo)。由圖2可知，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉酶解液的蛋白質(zhì)含量有較大影響。6種酶解液蛋白質(zhì)含量從大到小分別是AOSH、COSH、CCSH、CCRH、ACRH和ACSH。AOSH的蛋白質(zhì)含量最高，為0.718 g/100 g；ACSH的蛋白質(zhì)含量最低，為0.520 g/100 g。經(jīng)堿性蛋白酶處理，酶解液蛋白質(zhì)含量從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（0.718 g/100g）、中華草龜（0.569 g/100 g）和鱷龜（0.520 g/100 g）。經(jīng)復(fù)合蛋白酶處理，酶解液蛋白質(zhì)含量從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（0.700 g/100 g）、鱷龜（0.639 g/100 g）和中華草龜（0.597 g/100 g）。

圖1 蛋白酶種類對龜肉酶解液感官分值的影響

圖2 蛋白酶種類對龜肉酶解液蛋白質(zhì)含量的影響

圖3 蛋白酶種類對龜肉酶解液蛋白質(zhì)回收率的影響

由圖3可知，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉酶解液的蛋白質(zhì)回收率影響較大。6種酶解液蛋白質(zhì)回收率從大到小分別是AOSH、COSH、CCRH、CCSH、ACRH和ACSH。AOSH的蛋白質(zhì)回收率最高，為38.54%；ACSH的蛋白質(zhì)回收率最低，為24.85%。經(jīng)堿性蛋白酶處理，酶解液蛋白質(zhì)回收率從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（38.54%）、中華草龜（27.89%）和鱷龜（24.85%）。經(jīng)復(fù)合蛋白酶處理，酶解液蛋白質(zhì)回收率從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（34.53%）、中華草龜（29.97%）和鱷龜（29.19%）。中華花龜肉堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解液的蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)回收率均最高，表明中華花龜肉可能更容易受到這2種蛋白酶的水解。

2.3 蛋白酶種類對龜肉酶解液肽的分子質(zhì)量分布的影響

酶解液的呈味特性、功能特性、營養(yǎng)價值和生物活性等性質(zhì)與其所含的小分子肽密切相關(guān)。Ogasawara等[16]發(fā)現(xiàn)大豆水解液中分子質(zhì)量為1 000～5 000 Da的肽具有明顯的鮮味。韓國豆醬水提物中鮮味最強的組分是分子質(zhì)量為500～1 000 Da的短肽[17]。因此探究蛋白酶種類對龜肉酶解液肽的分子質(zhì)量分布的影響有重要意義。由圖4可知，6種龜肉酶解液蛋白均含有豐富的小肽，特別是小于1 000 Da的小肽。小于1 000 Da肽面積百分比最高的是COSH（97.10%），最低的是ACRH（71.11%）。1 000～2 000 Da肽面積百分比最高的是ACRH（18.73%），最低的是COSH（1.53%）。通常認(rèn)為小于2 000 Da的肽都可能具有較強的呈味特性和生物活性，分析龜肉酶解液中小于2 000 Da肽的分子質(zhì)量分布對了解其組成和活性有一定的指導(dǎo)意義。經(jīng)堿性蛋白酶處理，酶解液中小于2 000 Da肽面積百分比從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（92.01%）、鱷龜（91.45%）和中華草龜（89.84%）。經(jīng)復(fù)合蛋白酶處理，酶解液中小于2 000 Da肽面積百分比從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（98.64%）、鱷龜（97.19%）和中華草龜（96.42%）。

圖4 蛋白酶種類對龜肉酶解液肽的分子質(zhì)量分布的影響

2.4 蛋白酶種類對龜肉酶解液抗氧化活性的影響

羥自由基清除率是抗氧化活性評價的重要方法之一。羥自由基是細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)活性最強的氧族自由基。在金屬離子存在的條件下，羥自由基可由超氧陰離子和過氧化氫作用產(chǎn)生。它能與生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、多肽和DNA等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，對生物大分子產(chǎn)生最強的氧化破壞效應(yīng)，引起細(xì)胞與組織的氧化損傷，導(dǎo)致器官的病變和機體的衰老[14]。由圖5可知，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉酶解液的羥自由基清除率影響較大。6種酶解液蛋白質(zhì)回收率從大到小分別是COSH、AOSH、ACRH、ACSH、CCSH和CCRH。COSH的羥自由基清除率最大，為59.70%；CCRH的羥自由基清除率最小，為33.03%。經(jīng)堿性蛋白酶處理，酶解液羥自由基清除率從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（54.72%）、中華草龜（53.63%）和鱷龜（50.77%）。經(jīng)復(fù)合蛋白酶處理，酶解液羥自由基清除率從大到小的龜肉品種分別是中華花龜（59.70%）、中華草龜（33.03%）和鱷龜（37.07%）。中華花龜肉堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解液的羥自由基清除率均最高，表明中華花龜肉可能是較佳的抗氧化肽篩選的原料。

圖5 蛋白酶種類對龜肉酶解液羥自由基清除率的影響

3 結(jié)論

此次試驗采用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉進行酶解，考察其對酶解液感官、蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)回收率、肽的分子質(zhì)量分布和抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：ACRH的感官分值最高，為92.0分，其酶解液呈現(xiàn)澄清、淺黃色、無腥味、強烈鮮味和濃郁肉香味。AOSH的蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)回收率均最高，分別為0.718 g/100 g和38.54%。COSH的小于1 000 Da和小于2 000 Da肽面積百分比均最高，分別為97.10%和98.64%。COSH的羥自由基清除率最大，為59.70%。綜合考慮，COSH的感官分值為84.8分，具有肽面積百分比最高的小分子肽，且具有最大的羥自由基清除率，表明中華花龜肉復(fù)合蛋白酶酶解液可能具有較大的研究價值和開發(fā)前景，后續(xù)可以繼續(xù)深入研究其酶解條件優(yōu)化和功能性肽的挖掘與鑒定。