楊靜，趙子丹，牛艷，吳燕，王曉菁，張艷

(寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，寧夏 銀川 750002)

酚類(lèi)物質(zhì)作為葡萄中最豐富的次生代謝產(chǎn)物，具有抗炎、抗菌、抗氧化等功效[1-3]，主要分為類(lèi)黃酮和非類(lèi)黃酮兩大類(lèi)。酚酸作為一種非類(lèi)黃酮物質(zhì)，以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)2種形式存在于植物體中[4-8]。許多研究表明，酚酸具有清除自由基的作用，有很強(qiáng)的抗氧化能力。中國(guó)的鮮食葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種植面積不斷增加?，F(xiàn)階段，我國(guó)已基本形成寧夏賀蘭山東麓、新疆天山北麓等十大葡萄產(chǎn)區(qū)，其中以寧夏賀蘭山東麓為代表的西部產(chǎn)區(qū)近年來(lái)頗受關(guān)注[9-11]。它是繼河北昌黎、山東煙臺(tái)之后，第三個(gè)被國(guó)家認(rèn)定為葡萄酒原產(chǎn)地保護(hù)認(rèn)證的產(chǎn)區(qū)，是國(guó)際公認(rèn)的釀酒葡萄最佳產(chǎn)區(qū)之一，屬于世界優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄的種植“黃金地帶”[12-15]。宋文風(fēng)等[4]對(duì)葡萄果實(shí)的酚酸提取進(jìn)行了優(yōu)化，使酚酸的提取方法簡(jiǎn)單方便；張星星等[16-19]用UPLC技術(shù)快速測(cè)定葡萄酒中的酚類(lèi)物質(zhì)，使酚酸的檢測(cè)時(shí)間縮短。

本研究以賀蘭山東麓釀酒葡萄為主要研究對(duì)象，采用高效液相色譜技術(shù)，通過(guò)建立賀蘭山東麓釀酒葡萄中酚酸的組成和含量的檢測(cè)方法，分析酚酸在不同品種、產(chǎn)區(qū)中葡萄的組成分布和差異，為提高釀酒葡萄的品質(zhì)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；乙酸乙酯、乙醚(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；超純水(過(guò)0.45 μm濾膜)；沒(méi)食子酸、原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸，為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。購(gòu)買(mǎi)釀酒葡萄作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695液相色譜儀-配2487紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；電子天平(精度為0.000 1 g)；渦旋混勻器(德國(guó)MS3 digital)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；離心機(jī)(上海安亭TDL-40)；純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒DHG-9240A型)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

本實(shí)驗(yàn)以酚酸為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。準(zhǔn)確稱(chēng)取10.000 0 mg標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(精確到0.000 1 g)，用10 mL甲醇配置成1 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)母液，保存于-20 ℃。臨用前，用甲醇溶液稀釋成一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、30.0 mg·L-1)。

1.3.2 樣品前處理

采集的釀酒葡萄經(jīng)純水清洗擦干后，用高速勻漿機(jī)勻漿后，放于-20 ℃避光保存。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent-ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；波長(zhǎng)為280 nm。

表1 流動(dòng)相配比及洗脫時(shí)間

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件的確定

2.1.1 流動(dòng)相的確定

經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，以甲醇/水、乙腈/水為流動(dòng)相，均不能有效分離目標(biāo)成分酚酸。以乙腈/0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱可以有效分離目標(biāo)成分酚酸(圖1)。

1—沒(méi)食子酸；2—原兒茶酸；3—4-羥基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。圖1 波長(zhǎng)280 nm酚酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜

2.1.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

不同提取試劑對(duì)酚酸的提取。本研究選取乙腈、甲醇、乙酯乙酯+乙醚對(duì)釀酒葡萄中酚酸進(jìn)行提取。用乙腈和甲醇作為提取試劑無(wú)法將酚酸完全分離且提取雜質(zhì)較多，而用乙酸乙酯+乙醚提取，雜質(zhì)較少，組分能完全分離且提取也比較完全(圖2)。

a—乙腈提??；b—甲醇提??；c—乙酸乙酯+乙醚提?。?—沒(méi)食子酸；2—原兒茶酸；3—4-羥基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。圖2 不同提取試劑的酚酸色譜

不同提取方式對(duì)酚酸提取的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g葡萄樣品，加入20 mL乙酸乙酯+乙醚(V/V，1/1)，分別采用勻漿2 min、超聲10 min、振蕩10 min對(duì)酚酸進(jìn)行提取。提取后全部濃縮，2 mL甲醇定容，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)待測(cè)。結(jié)果表明，當(dāng)采用振蕩提取時(shí)提取效果最好(圖3)。

圖3 提取方式對(duì)釀酒葡萄中酚酸含量的影響

不同稱(chēng)樣質(zhì)量對(duì)酚酸提取的影響。分別稱(chēng)取1.00、2.00、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00 g葡萄樣品，對(duì)酚酸進(jìn)行10.00 mg·kg-1的添加回收，加入20 mL乙酸乙酯+乙醚(V/V，1/1)振蕩10 min對(duì)酚酸進(jìn)行提取，測(cè)定其回收率。當(dāng)稱(chēng)樣質(zhì)量為5.00 g時(shí)，回收率最高，說(shuō)明能將釀酒葡萄中的酚酸提取完全(圖4)。

圖4 稱(chēng)樣質(zhì)量對(duì)釀酒葡萄中酚酸含量的影響

2.1.3 釀酒葡萄樣品的高效液相色譜

通過(guò)確定的液相色譜條件和前處理?xiàng)l件對(duì)釀酒葡萄樣品中的酚酸進(jìn)行檢測(cè)，得到樣品空白的色譜圖，結(jié)果表明，前述確定的色譜條件和前處理?xiàng)l件對(duì)空白樣品無(wú)干擾(圖5)。

1—沒(méi)食子酸；2—原兒茶酸；3—4-羥基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。圖5 釀酒葡萄中酚酸液相色譜

2.1.4 酚酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、線(xiàn)性范圍及檢出限將酚酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液稀釋成0.2、0.5、1.0、5.0、10、30 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，采用外標(biāo)峰面積定量，以各酚酸的標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以其濃度為橫坐標(biāo)(x)，各酚酸的回歸方程、相關(guān)數(shù)和方法檢出限如表2。在0.2～30.0 mg·L-1，各種酚酸在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999 3～1.000 0，檢出限為0.02～0.04 mg·kg-1。據(jù)此確定在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)儀器響應(yīng)信號(hào)與進(jìn)樣量呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

表2 5種酚酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.1.5 精密度

將同一酚酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按照確定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來(lái)考察色譜方法的精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：沒(méi)食子酸的RSD為0.25%，原兒茶酸的RSD為1.36%，4-羥基苯甲酸的RSD為3.58%，香草酸的RSD為4.67%，丁香酸的RSD為0.98%，充分說(shuō)明該方法具有較高的精密度。

2.1.6 加標(biāo)回收率

以釀酒葡萄品種赤霞珠為實(shí)驗(yàn)材料，添加濃度分別為1.0、10.0、30.0 mg·L-1，每個(gè)濃度重復(fù)5次。采用已確定的前處理方法進(jìn)行提取，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，計(jì)算樣品中酚酸的回收率。沒(méi)食子酸的平均回收率為73.3%～95.1%，RSD為2.4%～5.6%；原兒茶酸的平均回收率為75.3%～79.4%，RSD為1.8%～5.9%；4-羥基苯甲酸的平均回收率為73.9%～105.1%，RSD為4.0%～5.8%；香草酸的平均回收率為78.7%～91.1%，RSD為5.0%～7.8%；丁香酸的平均回收率為74.3%～78.4%，RSD為3.3%～5.0%(表3)。樣品的回收率、重復(fù)性均能滿(mǎn)足檢測(cè)要求，表明方法的準(zhǔn)確度高、精密度好，完全能滿(mǎn)足釀酒葡萄中酚酸的檢測(cè)要求。

表3 5種酚酸組分的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

按照上述條件進(jìn)行檢測(cè)，釀酒葡萄樣品空白及樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖，見(jiàn)圖6、圖7。

1—沒(méi)食子酸；2—原兒茶酸；3—4-羥基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。圖6 釀酒葡萄樣品空白色譜圖

1—沒(méi)食子酸；2—原兒茶酸；3—4-羥基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。圖7 釀酒葡萄樣品添加回收色譜圖(10.0 mg·L-1)

2.2 釀酒葡萄中酚酸含量

2.2.1 不同品種釀酒葡萄中酚酸含量

釀酒葡萄中主要酚酸為沒(méi)食子酸和丁香酸，而4-羥基苯甲酸、原兒茶酸和香草酸含量較低(圖8)。赤霞珠的酚酸含量最高，之后依次為梅鹿輒、黑比諾、蛇龍珠、桑嬌維賽、霞多麗、威代爾。沒(méi)食子酸、原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、香草酸和丁香酸最高的葡萄品種分別為赤霞珠(19.3 mg·kg-1)、霞多麗(3.7 mg·kg-1)、黑比諾(2.3 mg·kg-1)、黑比諾(3.8 mg·kg-1)、赤霞珠(26.5 mg·kg-1)。說(shuō)明沒(méi)食子酸和丁香酸在一定程度上可以體現(xiàn)出釀酒葡萄中酚酸總含量情況。

圖8 不同品種釀酒葡萄中酚酸含量

2.2.2 不同產(chǎn)地釀酒葡萄中酚酸含量

圖9為紅寺堡匯達(dá)酒莊、永寧玉泉營(yíng)、青銅峽御馬酒莊3個(gè)產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄酚酸含量。蛇龍珠釀酒葡萄沒(méi)食子酸、原兒茶酸、香草酸和丁香酸在永寧玉泉營(yíng)產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)最好，分別為10.1、3.7、10.2、8.4 mg·kg-1，4-羥基苯甲酸在紅寺堡匯達(dá)酒莊產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)最好，為0.35 mg·kg-1(圖9)；梅鹿輒釀酒葡萄沒(méi)食子酸、原兒茶酸、香草酸在永寧玉泉營(yíng)產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)最好，分別為11.5、9.0、4.5 mg·kg-1，4-羥基苯甲酸和丁香酸在青銅峽御馬酒莊產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)最好，分別為0.64、22.8 mg·kg-1；赤霞珠釀酒葡萄沒(méi)食子酸、原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、香草酸和丁香酸在紅寺堡匯達(dá)酒莊產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)最好，分別為19.3、2.9、0.95、2.5、26.5 mg·kg-1。

圖9 不同產(chǎn)地釀酒葡萄中酚酸含量

2.3 葡萄中酚酸的主成分分析

主成分分析的目的主要在于利用原變量間具有較強(qiáng)相關(guān)性的特點(diǎn)，對(duì)多變量進(jìn)行降維，縮減成較少維度的數(shù)據(jù)，并且對(duì)降維后的特征指標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性變換，用少量指標(biāo)反映原始大量數(shù)據(jù)所提供的大部分信息[20-21]。利用SPSS 25.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)釀酒葡萄中的5種酚酸含量進(jìn)行主成分分析，得到主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率(表4)。特征值>1的共計(jì)2個(gè)主成分，第1主成分的貢獻(xiàn)率為48.346%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為26.888%，這2個(gè)成分的累積貢獻(xiàn)率為75.234%，說(shuō)明2個(gè)主成分能很好的反映原始數(shù)據(jù)絕大部分信息，因此,構(gòu)成釀酒葡萄酚酸組分特征的物質(zhì)由最初5個(gè)降到了2個(gè)主成分，成功達(dá)到了降維目的。

表4 各主成分的特征值和累積貢獻(xiàn)率

第1主成分主要是由丁香酸和沒(méi)食子酸構(gòu)成，第2主成分為4-羥基苯甲酸。得分系數(shù)反映各個(gè)指標(biāo)對(duì)主成分影響程度的判定依據(jù)，通過(guò)得分系數(shù)將各個(gè)變量進(jìn)行線(xiàn)性組合，建立關(guān)于第1主成分(Y1)和第2主成分(Y2)與丁香酸(X1)、沒(méi)食子酸(X2)、香草酸(X3)、原兒茶酸(X4)、4-羥基苯甲酸(X5)這5個(gè)變量得分系數(shù)模型(表5)。因此第1主成分可以提取為Y1=0.376X1+0.365X2+0.358X3+0.345X4-0.070X5；第2主成分可以提取為Y2=0.246X1+0.033X2-0.099X3-0.366X4+0.849X5。

表5 主成分載荷矩陣

3 小結(jié)與結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜儀測(cè)定賀蘭山東麓7個(gè)品種釀酒葡萄中5種酚酸含量。樣品的回收率、精密度均能滿(mǎn)足檢測(cè)要求，表明方法的準(zhǔn)確度高、精密度好，完全能滿(mǎn)足釀酒葡萄中酚酸的檢測(cè)要求。將本方法應(yīng)用于不同品種中賀蘭山東麓釀酒葡萄的測(cè)定，結(jié)果表明不同品種釀酒葡萄的酚酸均有檢出。由于含量高的成分不一定代表釀酒葡萄酚酸主成分，因此,用主成分分析法進(jìn)行分析，經(jīng)分析提取出2種主成分，其累積貢獻(xiàn)率達(dá)到75.234%。第1主成分為丁香酸和沒(méi)食子酸，第2主成分為4-羥基苯甲酸。實(shí)驗(yàn)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探討了釀酒葡萄中酚酸含量，為釀酒葡萄在今后葡萄酒釀制工藝提供了重要參考價(jià)值。