董宏圖，王曉冬，侯佩臣，羅斌，李愛學(xué)，張晗*

(1.北京農(nóng)業(yè)信息技術(shù)研究中心，北京 100094； 2.北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心，北京 100094)

柑橘黃龍病(Citrushuanglongbing)，又名青果病、黃梢病，素有“柑橘癌癥”之稱，可導(dǎo)致柑橘果樹的生長力逐漸衰弱(10年后死亡)，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致柑橘生產(chǎn)能力的突然喪失，是目前世界上柑橘類果樹最具毀滅性的病害之一[1]。我國作為世界上的柑橘生產(chǎn)大國之一，該病的傳播嚴(yán)重影響了我國柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[2]。截至目前，全國有12個(gè)省有過柑橘黃龍病發(fā)生的報(bào)道，病害影響面積達(dá)柑橘總種植面積的80%以上[3]。由于柑橘黃龍病病菌生長在柑橘屬植物韌皮部中，無法分離培養(yǎng)，一直不能確定其病原。直到20世紀(jì)90年代，才有相關(guān)研究確定了柑橘黃龍病病原為一種僅限于韌皮部篩管組織內(nèi)寄生的革蘭氏陰性細(xì)菌-韌皮部桿菌屬類細(xì)菌(CandidatusLiberibacter)[4]。隨后，依據(jù)其耐熱性和地理分布的特性將柑橘黃龍病分為3個(gè)種：亞洲種(CandidatusLiberibacterasiaticus，Las)、非洲種(CandidatusLiberibacterafricanus，Laf)和美洲種(CandidatusLiberibacteramericanus，Lac)。其中，亞洲種耐熱性最強(qiáng)，其次是美洲種，非洲種的耐熱性最差[5]。到目前為止，我國出現(xiàn)并檢測(cè)到的病原均為亞洲種。由于黃龍病病原體具有很長的潛伏期，并且無法分離培養(yǎng)，所以早期檢測(cè)與防治存在較大的困難。到目前為止，黃龍病檢測(cè)的方法有很多種，如傳統(tǒng)的田間診斷、指示作物檢測(cè)法、顯微鏡觀察等，這些方法雖成本較低、簡(jiǎn)單易行，但由于植株發(fā)病癥狀易與其他癥狀發(fā)生混淆，同時(shí)植株生長狀況差異較大，使得這些方法難以廣泛推廣[6]。此外，還有血清學(xué)檢測(cè)、高光譜檢測(cè)等方法，但這些手段成本消耗高、過程繁瑣[7]。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)方法廣為流行，最常用的是基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法，這種方法操作簡(jiǎn)單快捷，檢出結(jié)果靈敏精確[8]。但由于植株患病早期體內(nèi)的黃龍病菌含量較低、分布不均勻，導(dǎo)致黃龍病早期診斷的可靠性較低[9]，引物與DNA模板濃度的不同也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響[10]。

本實(shí)驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上選用使用率較高的幾對(duì)引物進(jìn)行比較，通過對(duì)PCR體系中的各物質(zhì)濃度進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，提升引物的特異性與靈敏度[11]，篩選用于黃龍病菌檢測(cè)的引物，優(yōu)化檢測(cè)反應(yīng)體系，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，為大規(guī)模均一化鑒定柑橘黃龍病提供一種快速低成本的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

黃龍病陽性樣品：采自江西贛州某黃龍病重癥果園的具有典型黃龍病斑駁癥狀的臍橙葉片。

黃龍病陰性樣品：為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的柑橘脫毒苗葉片。

特異性檢測(cè)對(duì)照樣品：從柑橘葉片分離培養(yǎng)的腐生菌。

空白對(duì)照：DNase-Free去離子水。

DNA提取試劑(CTAB法)、常規(guī)PCR試劑、DNA Marker D2000、瓊脂糖、10 000×GeneGreen核酸染料由北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司提供。

1.2 方法

引物特異性實(shí)驗(yàn)。以柑橘葉片腐生菌、黃龍病菌DNA為模板，ddH2O為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對(duì)電泳結(jié)果分析，篩選出僅能擴(kuò)增黃龍病菌的引物。

引物濃度優(yōu)化。在20 μL的PCR反應(yīng)體系下，引物的加入量分別為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 μL，PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(70 V，50 min)，選出各引物的最適濃度。

引物靈敏度檢測(cè)。將已知濃度的DNA溶液稀釋10、100、200、500、800、1 000、1 500、2 000、2 500、5 000、8 000、10 000倍，分別作為模板，20 μL PCR體系：10 μL Mix，4 μL模板，各引物的最佳濃度，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL，確定各引物所能擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物的最低模板濃度，檢測(cè)濃度最低的引物為靈敏度最佳引物。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選取引物對(duì)LSS606/LAS[12]、P1/P2[13]、16sf/16sr[11]、OI1/OI2[8]、A2/J5[14]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表1)(引物由上海生工合成)。

表1 引物序列及預(yù)期擴(kuò)增片段長度

DNA的提取(采用CTAB法)。將葉中脈剪成2～3 mm碎片，裝入2 mL無菌離心管中，加入直徑4 mm鋼珠，在盛有液氮的泡沫盒中預(yù)冷3 min，放入磨樣機(jī)研磨3 min，振頻18 Hz；向離心管中加入預(yù)熱的CTAB 800 μL，搖勻后放入水浴鍋中65 ℃水浴，每10 min取出搖一次；45 min后，向離心管中加入24∶1氯仿異戊醇600 μL，充分混勻，12 000 r·min-1離心10 min；吸取400 μL上清液加入到1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕搖勻，12 000 r·min-1離心10 min；倒出離心管中液體，加入600 μL 75%乙醇，10 000 r·min-1離心5 min；倒出液體，室溫干燥至白色沉淀變無色透明，加入50 μL ddH2O溶解30 min，存于冰箱-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)條件如表2所示，其中變性-退火-延伸設(shè)置35個(gè)循環(huán)。

表2 PCR反應(yīng)程序

2 結(jié)果與分析

利用柑橘黃龍病DNA作為模板，分別對(duì)5對(duì)引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，引物A2/J5、LSS606/LAS、16sf/16sr、P1/P2均能特異性擴(kuò)增出黃龍病菌DNA對(duì)應(yīng)的特征條帶，未擴(kuò)增出柑橘葉片腐生菌的條帶；而引物OI1/OI2則擴(kuò)增出2種模板的條帶(圖1)。說明引物對(duì)OI1/OI2特異性較差，因此，我們采用了其余幾組引物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

M為DNA marker；1～3為引物L(fēng)SS606/LAS特異性檢測(cè)結(jié)果；4～6為引物A2/J5特異性檢測(cè)結(jié)果；7～9為引物P1/P2特異性檢測(cè)結(jié)果；10～12為引物16sf/16sr特異性檢測(cè)結(jié)果；13～15為引物OI1/OI2特異性檢測(cè)結(jié)果。其中，每組模板順序分別是黃龍病病菌、陰性對(duì)照、柑橘葉片腐生菌。圖1 引物特異性的檢測(cè)情況

2.2 引物濃度優(yōu)化

對(duì)PCR反應(yīng)體系中引物的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，反應(yīng)體系見表3，電泳結(jié)果見圖2。

左上圖為引物16sf/16sr濃度優(yōu)化結(jié)果，右上為LSS606/LAS濃度優(yōu)化結(jié)果，左下為A2/J5濃度優(yōu)化結(jié)果，右下為P1/P2濃度優(yōu)化結(jié)果；1～6引物濃度依次為0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5 μmol，M為DNA marker。圖2 引物濃度優(yōu)化的電泳結(jié)果

根據(jù)電泳條帶結(jié)果顯示，16sf/16sr最佳濃度為0.3 μmol，LSS606/LAS的最佳濃度為0.2 μmol，A2/J5的最佳濃度為0.25 μmol，P1/P2的最佳濃度為0.3 μmol，各引物的最終PCR優(yōu)化體系見表3。

2.3 引物靈敏度檢測(cè)

對(duì)模板DNA進(jìn)行了不同倍數(shù)稀釋，利用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系，得到各引物能檢測(cè)的最低模板濃度(圖3)。

左上為引物L(fēng)SS606/LAS，右上為引物P1f/P1r，左下為引物16sf/16sr，右下為引物A2/J5(1～12稀釋倍數(shù)依次為10、100、200、500、800、1 000、1 500、2 000、2 500、5 000、8 000、10 000)。圖3 引物L(fēng)SS606/LAS，P1/P2，16sf/16sr與A2/J5靈敏度分析

根據(jù)電泳結(jié)果，引物P1/P2的最低檢測(cè)限為0.24 ng·μL-1，16sf/16sr的最低檢測(cè)限是0.48 ng·μL-1，引物L(fēng)SS606/LAS、A2/J5對(duì)模板DNA的靈敏度最高，在模板濃度為0.048 ng·μL-1(稀釋10 000倍)時(shí)仍能擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物。

3 小結(jié)與結(jié)論

本研究共對(duì)5對(duì)引物的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，分別為LSS606/LAS、16sf/16sr、A2/J5、P1/P2、OI1/OI2。研究結(jié)果顯示，當(dāng)引物濃度在0.2～0.3 μmol時(shí)，擴(kuò)增效果最好；其中引物OI1/OI2的特異性最差，LSS606/LAS與A2/J5具有更好的靈敏度。本論文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為柑橘黃龍病的后期檢測(cè)以及防治研究提供了基礎(chǔ)。

為保證實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，實(shí)驗(yàn)中特異性、靈敏度及最佳引物濃度檢測(cè)所用的模板均采用統(tǒng)一提取并混合均勻的柑橘黃龍病DNA，同時(shí)所有PCR循環(huán)次數(shù)均為35次，保證了所有實(shí)驗(yàn)過程的一致性。

考慮到柑橘葉片DNA提取過程中，除了黃龍病菌外，樣品中可能還參雜有其他柑橘類病菌DNA干擾實(shí)驗(yàn)，造成假陽性情況。因此，本文首先對(duì)選取的5對(duì)引物進(jìn)行了特異性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，供試的5對(duì)引物中，引物OI1/OI2除了目標(biāo)片段還擴(kuò)增出了柑橘葉片分離培養(yǎng)的腐生菌條帶，特異性較差外，其余4對(duì)引物均特異性識(shí)別目標(biāo)條帶，具有較好的特異性。

在前人[9]的研究中，對(duì)PCR體系中的dNTPs、Taq酶、Mg2+、引物都分別進(jìn)行過單因素的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。但由于本實(shí)驗(yàn)中用到的是2×Taq PCR Mix，其中已經(jīng)含有優(yōu)化濃度的Taq DNA Polymerase、dNTPs、Mg2+等預(yù)混合成分，所以本實(shí)驗(yàn)只針對(duì)引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)置0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5 μmol 6個(gè)引物濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增效果比較，結(jié)果顯示，當(dāng)引物濃度在0.2～0.3 μmol時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰、形成引物間二聚體較少。在此基礎(chǔ)上我們對(duì)各引物PCR體系進(jìn)行了優(yōu)化，確保引物靈敏度檢測(cè)是在優(yōu)化基礎(chǔ)上進(jìn)行的。另外本實(shí)驗(yàn)中采用了CTAB法提取樣品DNA[15]，若使用DNA提取試劑盒，可以有效去除蛋白、多糖等雜質(zhì)，提取到純度較高的樣品DNA，但是經(jīng)過試劑盒中吸附柱的過濾與吸附以后，DNA產(chǎn)率會(huì)降低。植株葉片中病菌含量相對(duì)較少，所以為了更高效的提取到更大濃度的DNA，并且降低雜質(zhì)污染，本實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)化的CTAB法提取樣品DNA，提高了緩沖液中CTAB濃度和NaCl濃度，相對(duì)于傳統(tǒng)CTAB法提高了提取效率，并可以有效去除雜質(zhì)污染。

在靈敏度檢測(cè)中，供試4對(duì)引物靈敏度大小依次為LSS606/LAS=A2/J5>16sf/16sr>P1/P2，靈敏度最高引物是最低引物的20倍，今后的早期檢測(cè)中可以選用靈敏度最高的2對(duì)引物，更早的檢測(cè)出柑橘果樹的感病情況。這與高玉霞等[11]研究中，常規(guī)PCR檢測(cè)柑橘黃龍病菌引物靈敏度16Sf/16Sr>P400f/P400r>P535f/P535r=OI1/OI2的部分研究結(jié)果一致。根據(jù)前人報(bào)道，新生葉片帶菌量平均為1 ng總DNA中的CLas細(xì)菌數(shù)在8 869～15 739個(gè)[16]，那么通過本實(shí)驗(yàn)完善的檢測(cè)體系，靈敏度最高的引物可檢測(cè)出1 ng總DNA中的CLas細(xì)菌數(shù)在426～755個(gè)。利用本文篩選出的檢測(cè)引物及實(shí)驗(yàn)體系可以較好的實(shí)現(xiàn)柑橘黃龍病菌的早期檢測(cè)。

因此，基于分子生物學(xué)方法的PCR技術(shù)漸漸被應(yīng)用于柑橘黃龍病的研究當(dāng)中，為黃龍病菌的早期診斷及后期的及時(shí)防控提供了條件[14]。而本實(shí)驗(yàn)中引物靈敏度的提高能有效降低假陰性的情況，能夠滿足早期定性診斷的需要。在做PCR檢測(cè)時(shí)，每組實(shí)驗(yàn)都至少重復(fù)2次，并設(shè)置陰性或者陽性對(duì)照，避免誤差或者由于操作失誤導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。