李玲蔚 李海昆 于瑞海 馬培振 張 哲 王永旺

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266003)

熊本牡蠣(Crassostrea sikamea)屬于巨牡蠣屬(Crassostrea), 在中國、日本和韓國的沿海均有分布[1—3], 其獨(dú)特的口味深受消費(fèi)者的喜愛,被美國引進(jìn)并成功地開展了生產(chǎn)養(yǎng)殖[4—6]。我國熊本牡蠣的野生群體主要分布于江蘇以南的海區(qū), 是我國自然分布的幾種巨牡蠣屬牡蠣之一, 但因個(gè)體小、產(chǎn)量低, 未被開發(fā)利用[5,7,8]。美國的熊本牡蠣大小適中,出肉率較高, 肉質(zhì)細(xì)膩具甜味, 在美國頗受消費(fèi)者的青睞, 價(jià)格是長牡蠣的1倍以上,也是我國酒店進(jìn)口高檔牡蠣的主要品種之一。目前國內(nèi)養(yǎng)殖戶迫切需要大量熊本牡蠣滿足日益增長的客戶需求, 因此, 熊本牡蠣在我國具有較大的開發(fā)潛力。同時(shí),開發(fā)熊本牡蠣作為我國一個(gè)新的養(yǎng)殖品種對(duì)解決我國牡蠣養(yǎng)殖業(yè)面臨的養(yǎng)殖品種單一, 種質(zhì)退化等問題具有重要意義[8]。目前, 熊本牡蠣已經(jīng)在國內(nèi)已經(jīng)開展了人工繁育[5—9]、單體培育[8]、多倍體育種[10]、性狀選擇育種[11,12]和雜交育種[13,14]等方面的研究, 取得了一定的成效。

熊本牡蠣雖然品質(zhì)好、殼形規(guī)則, 但殼厚、生長緩慢、產(chǎn)量低[5]。貝類的三倍體因不育性往往比二倍體生長快[15,16], 熊本牡蠣的三倍體育種有望改善其生長慢的劣勢(shì), 提高生長速度。武祥偉等[10]報(bào)道了用CB誘導(dǎo)熊本牡蠣三倍體的研究, CB誘導(dǎo)的效率較高, 但是其成本較高且毒性大。6-DMAP及鹽度誘導(dǎo)也是常見的牡蠣三倍體的誘導(dǎo)方法, 與CB相比這2種方法在經(jīng)濟(jì)性、安全性上具有一定的優(yōu)勢(shì), 但誘導(dǎo)效率稍低。本次研究探討了6-DMAP、低鹽和高鹽3種方式對(duì)熊本牡蠣的誘導(dǎo)效果, 以期獲得更加環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、無毒害的誘導(dǎo)方案,為獲得四倍體熊本牡蠣進(jìn)而開展三倍體熊本牡蠣的規(guī)模化育種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 親貝暫養(yǎng)

本次實(shí)驗(yàn)所用的熊本牡蠣來自美國俄勒岡州,挑選貝殼完整、活力良好親貝, 將其表面附著物洗刷干凈后, 運(yùn)至山東省煙臺(tái)萊州市長漁水產(chǎn)有限公司室內(nèi)育苗車間暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間水溫26—27℃, 鹽度28—30。每天換水2次, 采用吸底的方式換水?；旌贤段骨虻缺藿鹪?Isochrysis galbana)和新月菱形藻(Nitzschia closterium), 根據(jù)具體的攝食和水體中殘餌情況調(diào)整投餌量。

1.2 解剖受精

采用解剖的方式獲得精卵, 獲得的卵液先經(jīng)60 μm的尼龍篩絹過濾除去大組織塊, 之后用25 μm的尼龍篩絹洗卵3次, 最后將卵液濃縮至一定的體積, 便于確定誘導(dǎo)濃度(鹽度)。置于過濾海水中浸泡促熟, 促熟時(shí)間30—60min。精液經(jīng)25 μm的篩絹過濾, 稀釋后直接使用。下列每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 6-DMAP誘導(dǎo)

誘導(dǎo)濃度實(shí)驗(yàn)參考秦艷平等[17]報(bào)道的香港牡蠣三倍體誘導(dǎo)的最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī), 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)設(shè)為受精后15min, 分別將受精卵置于55、60、65、70、75和80 mg/L 的6-DMAP 中持續(xù)誘導(dǎo)20min。

誘導(dǎo)時(shí)機(jī)實(shí)驗(yàn)分別在受精后12min、15min、18min和21min四個(gè)時(shí)刻, 用濃度實(shí)驗(yàn)中最適宜濃度, 持續(xù)處理受精卵20min 。

誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間實(shí)驗(yàn)采用濃度試驗(yàn)和誘導(dǎo)時(shí)機(jī)試驗(yàn)的最佳組合, 將受精卵分別持續(xù)誘導(dǎo)10min、15min、20min和25min。

1.4 鹽度誘導(dǎo)

高鹽海水用海鹽加海水母液配置獲得, 低鹽海水用經(jīng)24h曝氣后的淡水與海水母液混合獲得, 配置不同鹽度海水時(shí)將濃縮后卵液的體積計(jì)算在內(nèi),確保最終的誘導(dǎo)鹽度。

誘導(dǎo)鹽度實(shí)驗(yàn)參考秦艷平等[17]報(bào)道的香港牡蠣三倍體誘導(dǎo)的最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī), 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)設(shè)為受精后15min, 將受精卵分別在鹽度為35、40、45、50、55和60的高鹽海水及3、6、9、12、15和18的低鹽海水中持續(xù)誘導(dǎo)20min。

誘導(dǎo)時(shí)機(jī)實(shí)驗(yàn)分別在受精后的12min、15min、18min和21min 四個(gè)時(shí)刻內(nèi)分別用高鹽和低鹽實(shí)驗(yàn)中的最適誘導(dǎo)鹽度持續(xù)誘導(dǎo)20min。

誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)機(jī)實(shí)驗(yàn)用誘導(dǎo)時(shí)機(jī)實(shí)驗(yàn)中最適誘導(dǎo)時(shí)機(jī), 將受精卵分別在高鹽和低鹽實(shí)驗(yàn)中的最適誘導(dǎo)鹽度中持續(xù)誘導(dǎo)10min、15min、20min和25min。

1.5 幼蟲的培養(yǎng)

分別用1.3中獲得的6-DMAP、低鹽和高鹽最佳誘導(dǎo)組合誘導(dǎo)熊本牡蠣三倍體, 將不同三倍體誘導(dǎo)組的幼蟲繼續(xù)培育。培育期間, 水溫26—28℃,鹽度30; 每天投喂球等鞭金藻4次, 日投餌量6000—8000 cells/mL, 具體投餌量根據(jù)攝食和殘餌情況進(jìn)行調(diào)整; 每天換水兩次, 每次換水1/2。

1.6 倍性檢測(cè)

將收集獲得的幼蟲置于PBS緩沖液(pH=7.4)中,用1 mL注射器抽打3—5次制成細(xì)胞懸液, 將細(xì)胞懸液用25 μm的篩絹過濾至75%的酒精中固定24h以上。上機(jī)檢測(cè)前用DAPI(2 μg/mL)將獲得的幼蟲細(xì)胞從酒精中置換出, 避光染色30min, 隨后用流式細(xì)胞儀(CytoFLEX, 美國)檢測(cè)三倍體率。

1.7 數(shù)據(jù)測(cè)量與處理

受精后24h收集D形幼蟲檢測(cè)三倍體率。幼蟲培育期間每隔3d測(cè)量幼蟲殼高和存活率; 各組分別在幼蟲培育的第5、第9、第13和第17天隨機(jī)取500—1000個(gè)幼蟲檢測(cè)三倍體率。卵裂率為受精4h后發(fā)生卵裂的受精卵占總受精卵的百分比, 孵化率為受精后24后D形幼蟲占卵裂的受精卵的百分比;三倍體率為組內(nèi)所有幼蟲中三倍體幼蟲占的百分比; 誘導(dǎo)效率為孵化率與三倍體率乘積的百分?jǐn)?shù);幼蟲的平均存活率為所有的幼蟲在培育24d內(nèi)的平均存活率; 幼蟲的生長率為所有幼蟲在培育24d內(nèi)的平均生長速度。使用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 采用單因素方差分析(One-way ANOVA), 并進(jìn)行Duncan多重比較, 顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 三種誘導(dǎo)方式在不同的誘導(dǎo)組合下卵裂率、孵化率、三倍體率比較

在6-DMAP誘導(dǎo)組中, 隨誘導(dǎo)濃度的增加, 卵裂率和孵化率持續(xù)下降, 而三倍體率先增大后減小;濃度為75 mg/L時(shí)誘導(dǎo)三倍體率最高為(58.0±3.67)%,對(duì)應(yīng)的卵裂率和孵化率分別為(75.42±5.33)%和(73.26±3.15)%(圖1A)。在低鹽誘導(dǎo)組中隨鹽度的增加, 卵裂率和孵化率逐漸升高, 三倍體率先升高后降低; 在鹽度為6時(shí), 三倍體率最高可達(dá)(42.25±2.63)%, 顯著高于其他各組(P＜0.05), 此時(shí)對(duì)應(yīng)的卵裂率和孵化率分別為(76.51±7.22)%和(74.33±3.71)%(圖2B)。在高鹽誘導(dǎo)組中, 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各組的卵裂率和孵化率差異較小, 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的三倍體率隨鹽度的增加先增大后減小; 在鹽度為55時(shí), 三倍體率最高可達(dá)(60.03±3.03)%, 卵裂率和孵化率分別可達(dá)(80.26±3.78)%和(78.39±4.32)%(圖1C)。

在6-DMAP誘導(dǎo)組中, 隨著起始誘導(dǎo)時(shí)間的增大, 卵裂率和三倍體率先增大后減小; 起始誘導(dǎo)時(shí)間為受精后15min時(shí), 誘導(dǎo)獲得三倍體率最高為(53.92±7.07)%, 顯著高于起始誘導(dǎo)時(shí)間為受精后12min和21min時(shí)的三倍體率(P＜0.05), 此時(shí)的卵裂率和孵化率分別可達(dá)(86.08±2.94)%和(76.13±5.12)%(圖2A)。在低鹽誘導(dǎo)組中, 隨起始誘導(dǎo)時(shí)間的增加, 三倍體率先增大后減小; 在起始誘導(dǎo)時(shí)間為15min時(shí), 三倍體率最高達(dá)(40.89±3.13)%, 卵裂率和孵化率也相對(duì)較高, 分別可達(dá)(76.51±3.11)%和(75.17±4.01)%(圖2B)。在高鹽誘導(dǎo)組中, 隨起始誘導(dǎo)時(shí)間的增加, 三倍體率先增大后減小; 起始誘導(dǎo)時(shí)間為受精后15min時(shí), 三倍體率最大可達(dá)(59.52±4.32)%, 卵裂率和孵化率分別可達(dá)(81.4±3.76)%和(78.1±3.59)%(圖2C)。

圖1 不同的誘導(dǎo)濃度(鹽度)下3種誘導(dǎo)方法對(duì)熊本牡蠣三倍體誘導(dǎo)效果Fig.1 Effects of three induction methods on triploid induction of C.sikamea at different induction concentrations (salinity)

圖2 不同的起始誘導(dǎo)時(shí)間下3種誘導(dǎo)方法對(duì)熊本牡蠣三倍體誘導(dǎo)效果Fig.2 Effects of three induction methods on triploid induction of C.sikamea at different initial induction times

在6-DMAP誘導(dǎo)組中, 隨誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間的增大,三倍體率先增大后減小, 卵裂率和孵化率逐漸降低。在誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間20min時(shí), 三倍體率最高可達(dá)(51.77±5.42)%, 此時(shí)對(duì)應(yīng)的卵裂率和孵化率分別為(79.04±4.77)%和(81.76±6.72)%(圖3A)。在低鹽誘導(dǎo)組中, 各組的三倍體率普遍較低, 三倍體率只有16.74%—37.98%; 隨誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間增加, 各組的卵裂率逐漸降低, 三倍體率先增加后減小, 但孵化率無明顯的變化; 在誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為20min時(shí), 三倍體率最高達(dá)(37.98±5.05)%, 此時(shí)卵裂率和孵化率分別為(77.40±5.52)%和(84.51±7.61)%(圖3B)。在高鹽誘導(dǎo)組中, 各組間三倍體率可達(dá)35.26%—56.48%;隨誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間的增大, 三倍體率先增大后減小, 卵裂率和孵化率逐漸降低; 在誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間20min時(shí), 三倍體率最高可達(dá)(56.48±4.83)%, 卵裂率和孵化率分別可達(dá)(82.16±3.29)%和(83.46±3.78)% (圖3C)。

2.2 不同誘導(dǎo)條件下3種誘導(dǎo)方法三倍體誘導(dǎo)的誘導(dǎo)效率比較

在不同的鹽度條件下, 低鹽組和高鹽組的誘導(dǎo)效率變化范圍均較大, 其最大誘導(dǎo)效率出現(xiàn)在鹽度為6和55時(shí), 分別可達(dá)31.41%和49.41%; 在不同的6-DMAP濃度條件下, 誘導(dǎo)效率變化相對(duì)較小, 濃度為75 mg/L時(shí), 誘導(dǎo)效率最大可達(dá)42.50%(圖4A)。隨起始誘導(dǎo)時(shí)間的增大, 3種誘導(dǎo)方式的誘導(dǎo)效率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì), 6-DMAP、低鹽和高鹽3種誘導(dǎo)方式的最大誘導(dǎo)效率均出現(xiàn)在起始誘導(dǎo)時(shí)間15min時(shí), 分別可達(dá)40.75%、30.47%和46.48%(圖4B)。隨誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間的增大, 3種誘導(dǎo)方式的誘導(dǎo)效率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì); 6-DMAP、低鹽和高鹽3種誘導(dǎo)方式的最大誘導(dǎo)效率均出現(xiàn)在誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間20min時(shí), 分別可達(dá)42.33%、32.10%和47.14%(圖4C)。

2.3 三種誘導(dǎo)方式獲得的幼蟲的生長、存活、三倍體率比較

在幼蟲培育的前6天, 對(duì)照組以及各三倍體誘導(dǎo)組的幼蟲殼高無顯著性差異(P＞0.05)。自培育的第9天開始, 處理組幼蟲生長逐漸加快。培育的第9至第24天處理組的幼蟲殼高始終大于對(duì)照組。在3個(gè)三倍體誘導(dǎo)組中, 高鹽誘導(dǎo)組的幼蟲生長速度最快, 其次是6-DMAP誘導(dǎo)組和低鹽誘導(dǎo)組的幼蟲,但在培育期間各組之間的幼蟲殼高均無顯著性差異(P＞0.05, 圖5)。

對(duì)照組幼蟲的存活率始終顯著高于3個(gè)誘導(dǎo)組的幼蟲存活率, 培育至24d, 對(duì)照組的存活率達(dá)(15.58±2.17)%, 而三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的幼蟲存活率均不到5%。在3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中, 6-DMAP三倍體誘導(dǎo)組幼蟲的存活率始終最低, 第24天時(shí)幼蟲存活率只有(2.78±0.23)%, 不到對(duì)照的30%。低鹽和高鹽誘導(dǎo)組獲得的幼蟲群的存活率差異較小, 培育至24d幼蟲存活率分別達(dá)(3.51±0.77)%和(4.37±2.57)%(圖6)。

在3種誘導(dǎo)方式中, 高鹽誘導(dǎo)組獲得的三倍體率最高, 其次是6-DMAP和低鹽組。培育至17d, 3種誘導(dǎo)方式獲得的幼蟲的倍率均有所下降。低鹽誘導(dǎo)組和6-DMAP誘導(dǎo)組三倍體率降低幅度較大, 第13天之后, 其三倍體幼蟲的比例顯著低于高鹽組(P＜0.05)。6-DMAP、高鹽和低鹽3種誘導(dǎo)方式獲得的幼蟲的三倍體率分別由最初的(73.41±3.98)%、(75.69±4.33)%和(66.53±6.72)%降低至(48.47±3.17)%、(58.05±6.455)%和(47.45±4.82)%(圖7)。

2.4 三種誘導(dǎo)方式的綜合比較

3種誘導(dǎo)方式的綜合比較如表1所示, 在3種誘導(dǎo)方式中, 低鹽的誘導(dǎo)效率顯著地低于另外2種誘導(dǎo)方式, 6-DMAP誘導(dǎo)組和高鹽誘導(dǎo)組相比, 6-DMAP誘導(dǎo)的最大三倍體率稍低于高鹽誘導(dǎo)的最大三倍體率。鹽度誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)成本低且無毒, 而6-DMAP誘導(dǎo)組成本較高且有一定毒性。6-DMAP誘導(dǎo)組幼蟲的三倍體率衰退最大, 且幼蟲平均存活率低于2個(gè)鹽度組。

圖3 不同的誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間下3種誘導(dǎo)方法對(duì)熊本牡蠣三倍體誘導(dǎo)效果Fig.3 Effects of three induction methods on triploid induction of C.sikamea at different induction duration times

3 討論

3.1 最佳誘導(dǎo)組合的探討

本次實(shí)驗(yàn)的藥物濃度梯度較大, 發(fā)現(xiàn)隨誘導(dǎo)濃度的增加, 三倍體率先增加后有所下降, 這在6-DMAP誘導(dǎo)三倍體香港牡蠣和長牡蠣中均出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象[17,18]。而Gérard等[19]的研究結(jié)果表明隨6-DMAP濃度的增加和誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間的增長, 誘導(dǎo)獲得的三倍體率先顯著升高, 后逐漸趨于平緩, 這與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同。主要原因可能是當(dāng)誘導(dǎo)濃度過大時(shí), 幼蟲胚胎受損嚴(yán)重, 胚胎畸形率增加, 很多三倍體胚胎無法正常發(fā)育至D形幼蟲, 導(dǎo)致D形幼蟲的三倍體率有所下降[20]。其次誘導(dǎo)強(qiáng)度過大時(shí), 很多胚胎無法完成細(xì)胞分裂過程, 這些無法分裂的胚胎往往中往往包含較多的多倍體胚胎。實(shí)際上這也可以解釋鹽度實(shí)驗(yàn)中隨鹽度脅迫的增加, 誘導(dǎo)三倍體率先增加后減小的現(xiàn)象, 此外近江牡蠣、長牡蠣的鹽度誘導(dǎo)中均出現(xiàn)了隨鹽度脅迫的增加, 三倍體率先增加后減小的現(xiàn)象[21,22]。

三組均在起始誘導(dǎo)時(shí)間為15min時(shí)出現(xiàn)了最高的誘導(dǎo)效率, 說明受精后15min時(shí)是熊本牡蠣受精卵第二極體集中排放的時(shí)間點(diǎn), 是3種方式的最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī); 3種誘導(dǎo)方法中在持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間20min時(shí)均表現(xiàn)出了最高的誘導(dǎo)效率; 綜合卵裂率、孵化率和三倍體誘導(dǎo)率, 在6-DMAP實(shí)驗(yàn)中, 當(dāng)6-DMAP濃度為75 mg/L, 起始誘導(dǎo)時(shí)間受精后15min, 持續(xù)誘導(dǎo)20min時(shí), 誘導(dǎo)效果最好; 在低鹽誘導(dǎo)組中, 當(dāng)鹽度為6, 起始誘導(dǎo)時(shí)間為, 受精后15min, 持續(xù)誘導(dǎo)20min時(shí), 誘導(dǎo)效果最好; 在高鹽實(shí)驗(yàn)中, 鹽度55, 起始誘導(dǎo)時(shí)間受精后15min, 持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間15min時(shí),誘導(dǎo)效果最好。

3.2 最佳誘導(dǎo)方法的探討

綜合來看, 低鹽誘導(dǎo)組的效率較低, 其獲得幼蟲的平均存活率低, 且三倍體率不穩(wěn)定, 為3種方法中誘導(dǎo)效果最差的一種。6-DMAP誘導(dǎo)最高三倍體率通常能達(dá)到80%以上[17—20], 但本次研究的三倍體率遠(yuǎn)低于此, 這可能與卵子的成熟度、操作熟練程度和不同種對(duì)不同藥物的耐受性等因素有關(guān)[17]。因此在貝類的三倍體誘導(dǎo)過程中每個(gè)環(huán)節(jié)都要嚴(yán)謹(jǐn), 否則誘導(dǎo)的不穩(wěn)定性會(huì)大大地增加。在本次實(shí)驗(yàn)中, 與6-DMAP誘導(dǎo)組相比, 高鹽誘導(dǎo)組表現(xiàn)出了一定的優(yōu)越性, 其最高誘導(dǎo)效率高于6-DMAP誘導(dǎo),且誘導(dǎo)獲得幼蟲的三倍體率較穩(wěn)定、平均存活率高、無毒環(huán)保和成本低。因此高鹽誘導(dǎo)熊本牡蠣是3種方法中最優(yōu)的一種。

3.3 三種誘導(dǎo)方式獲得幼蟲的生長、存活和三倍體率探討

圖4 不同的誘導(dǎo)條件下3種誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)熊本牡蠣三倍體的誘導(dǎo)效率Fig.4 Induction efficiency of three induction methods on triploid induction of C.sikamea at different induction conditions

3種誘導(dǎo)方式獲得的浮游幼蟲在生長上無顯著性差異(P＞0.05), 但在培育的第9至第24天, 其幼蟲的殼高均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。三倍體誘導(dǎo)組幼蟲在殼頂期幼蟲之后表現(xiàn)出了一定的生長誘導(dǎo)優(yōu)勢(shì), 在殼頂期之前未表現(xiàn)出任何的生長優(yōu)勢(shì), 分析原因是殼頂前期存在一定比例的非整倍體幼蟲,這些非整倍體幼蟲與正常的二倍體個(gè)體相比存在一定的生長劣勢(shì)[23], 導(dǎo)致其沒有表現(xiàn)出生長優(yōu)勢(shì),而殼頂期之后這些幼蟲被淘汰[10], 幼蟲逐漸表現(xiàn)出生長優(yōu)勢(shì)。三倍體誘導(dǎo)組的幼蟲的存活率顯著低于對(duì)照組, 主要是與非整倍體的死亡以及存活力弱的D形幼蟲的淘汰有關(guān)[10]。

圖5 三種誘導(dǎo)方式獲得的幼蟲的殼高比較Fig.5 Comparison in shell height of larvae induced by three methods

圖6 三種誘導(dǎo)方式獲得的幼蟲的存活率比較Fig.6 Comparison on survival rate of triploid larva population induced by three methods

自Stanley等[24]1981年首次報(bào)道三倍體美洲牡蠣以來, 雙殼貝類的多倍體育種發(fā)展迅速, 三倍體牡蠣的規(guī)模化養(yǎng)殖是雙殼貝類進(jìn)行多倍體育種的一個(gè)成功的典范[25,26], 但是在貝類的多倍體育種中也存在一些問題。多倍體群體的倍率衰退是貝類多倍體育種的一個(gè)重要的問題, 限制了穩(wěn)定的三倍體和四倍體牡蠣群體的形成[27—29]。在本研究中3種誘導(dǎo)方式獲得的幼蟲均出現(xiàn)了不同程度的倍率衰退, 分析原因有三: 首先是個(gè)體的選擇性死亡, 被抑制第二極體排放而獲得三倍體屬于非正常的個(gè)體,一部分個(gè)體由于不能適應(yīng)這種現(xiàn)象在培育前期大量死亡, 造成整體的三倍體率下降[10]; 其次是非整倍體個(gè)體存在, 其染色體不穩(wěn)定性也可能造成三倍體率的下降; 此外研究中檢測(cè)倍率的方法是流式細(xì)胞儀檢測(cè), 流式細(xì)胞儀并不能檢測(cè)出DNA含量的微小差別, 檢測(cè)的三倍體中可能包含一定比例的非整倍體個(gè)體[30], 隨著非整倍體的死亡三倍體率逐漸下降; 最后一個(gè)原因就是染色體的丟失, 三倍體個(gè)體的染色體丟失逆轉(zhuǎn)成為二倍體或者非整倍體會(huì)造成三倍體群體的三倍體率的下降。目前認(rèn)為這種染色體丟失現(xiàn)象主要是由于細(xì)胞分裂過程中形成染色體叢造成的[29,31], 并且這種現(xiàn)象廣泛地存在于三倍體[29]和四倍體牡蠣[31]中。

圖7 三種誘導(dǎo)方式獲得的幼蟲的三倍體率比較Fig.7 Comparison on triploidy rate of larva induced by three methods

表1 三種三倍體誘導(dǎo)方法的綜合比較Tab.1 Comprehensive comparison on three triploid induction methods

4 結(jié)論

在6-DMAP、高鹽和低鹽3種誘導(dǎo)方式中, 低鹽的誘導(dǎo)效果最差, 不適合三倍體熊本牡蠣的誘導(dǎo)。高鹽誘導(dǎo)的三倍體率最高, 幼蟲的三倍體率穩(wěn)定、存活率高, 且成本低、環(huán)保、無毒害, 是誘導(dǎo)三倍體熊本牡蠣的理想方法。在實(shí)際的熊本牡蠣三倍體誘導(dǎo)生產(chǎn)中, 建議以高鹽的誘導(dǎo)方式進(jìn)行誘導(dǎo),最佳誘導(dǎo)條件為鹽度55, 起始誘導(dǎo)時(shí)間為受精后15min, 持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間為20min。